Box－Behnken效应面法优化牛蒡苷pH敏感脂质体处方

武鑫朋，孙李妍，2，慕宏杰，杨绍梅，魏俊花，周绣棣，陈大全

(1.烟台大学药学院，山东烟台264005;2.烟台山医院，山东烟台264001)

牛蒡苷(arctiin，AC)具有显著的抗菌，抗病毒，抗肿瘤，抗PAF受体作用，在体内被分解为牛蒡苷元而产生众多药理作用，具有很高的新药开发价值。经家兔静脉注射牛蒡苷元10 mg·kg－1，其药物动力学行为符合单室模型，消除半衰期t1/2(Ke)为52.164 73 min，药物体内消除较快，故该药较适合制成缓释剂型［5～8］。鉴于人体阴道pH值为4～5，本研究将其设计为pH敏感脂质体，并初步考察其稳定性，拟为今后研制其凝胶剂型及其体内研究奠定基础。

Box－Behnken效应面法是Design Expert(7.1.4试用版，Stat－Ease Inc)实验设计软件中的一种实验设计方法，许多国外药学工作者已将其用于制剂处方的优化，而国内仍为少见。作者采用薄膜分散法制备了牛蒡苷pH敏感脂质体，并采用Box－Behnken效应面法对处方进行优化［9］。

本实验拟通过构建牛蒡苷pH敏感脂质体，通过Box－Behnken效应面法优选处方并对其进行一系列性质研究。

1 仪器与试药

RE252A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，NicompTM 380动态光散射粒度测定仪(SantaBarbara，USA PSS)，JM21200EX透射电镜(日本电子公司)。

牛蒡苷(纯度质量分数＞99.15%，东北制药总厂)，大豆磷脂(注射级，上海太伟药业有限公司)，胆固醇(生化级，天津博迪化工有限公司)，pH敏感材料mPEG2000－Hz－Chol(PHC)(实验室自己合成)，三氯甲烷、甲醇(色谱纯，山东禹王试剂有限公司)，其他试剂(分析纯，市售)。

2 实验方法与结果

2.1 AC脂质体的制备

2.1.1 AC脂质体的制备 称取处方量的AC原料药、大豆磷脂、胆固醇、PHC，溶于适量三氯甲烷中，置于250 mL茄形瓶中，在42℃减压除去有机溶剂，得到透明均匀薄膜，继续抽真空10 min后，加入磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)，在20℃条件下超声水化磷脂膜30 min后过0.45 μm微孔滤膜，得到略带乳光脂质体混悬液，于4℃下保存备用。

在河湖周边区，结合平原区造林，在城市河道两侧50～100 m范围内，按照乔灌草立体配置模式，建设河滨植物过滤带，进一步过滤、净化入河水质。

2.1.2 实验条件筛选 a.按2.1.1中处方，将茄形瓶改为50 mL和500 mL体积，其余操作同上制备脂质体;b.按2.1.1中处方，将温度改为38℃和45℃，其余操作同上制备脂质体;c.按2.3步骤测定脂质体包封率和载药量并进行比较，结果:选择250 mL茄形瓶，设定旋蒸温度为42℃制备脂质体，此时得到的脂质体包封率及载药量最高。

2.1.3 实验方法筛选 按照2.1.1中处方，分别采用逆向蒸发法、注入法、pH梯度法等制备脂质体，并测其包封率，结果:薄膜分散法所制备的脂质体包封率最高。

2.2 含量测定方法学的建立［8～10］

2.2.1 检测波长选择 分别称取AC对照品与空白辅料适量，加甲醇溶解，配制成一定浓度的AC和辅料溶液，分别在200～400 nm内进行紫外扫描。AC在280 nm处有最大吸收，且空白辅料不干扰测定，选定检测波长为280 nm。

2.2.2 标准曲线的制备 精密称取AC对照品置量瓶中，以甲醇配制成质量浓度为0.102 mg·mL－1贮备液，稀释得到质量浓度分别为0.0102、0.0204、0.0306、0.0408、0.051、0.0612 mg·mL－1溶液。按“2.2.1”在280 nm处测定吸光度(A)，以吸光度(A)对药物质量浓度(C)作线性回归，得标准曲线方程为:A=16.509×C+0.008 9(R2=0.999 9)。结果表明，AC质量浓度在0.010 2～0.061 2 mg·mL－1内与吸光度呈良好的线性关系。

高、中、低3个质量浓度的日内、日间精密度良好，RSD均小于2%。

2.3 AC脂质体包封率及载药量的测定 采用过膜法测定脂质体的包封率。精密量取脂质体0.3 mL置10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.2.2”中UV法测定溶液中AC含量。药物包封率(entrapment efficiency，EE)、载药量(loading content，LC)计算公式如下:EE%=ρ测 /ρ总×100;LC%=(m总－m游离)/m脂质×100。式中ρ总、ρ测分别代表投入脂质体溶液中AC的总质量浓度、被包封AC的质量浓度;m测、m脂质分别代表单位体积脂质体包封AC的量以及制备单位体积脂质体所用脂质的量。

2.4 脂质体粒径的测定 动态光散射粒度测定仪测定牛蒡苷脂质体的粒径大小及分布，结果如图1，表明脂质体粒径在228 nm左右，呈正态分布。

图1 牛蒡苷pH敏感脂质体粒径分布

2.5 Box－Behnken效应面法优化处方试验 在预实验的基础上，选择对脂质体性质影响较显著的3个因素:磷脂－胆固醇比(X1)、磷脂－药质量比(X2)、pH敏感材料含量(X3)作为考察对象。以包封率(Y1，EE)、载药量(Y2，LC)及粒径(Y3，d)为评价指标，安排试验，因素水平见表1，试验结果见表2。

表1 Box－Behnken设计因素水平

2.5.1 二次回归模型的建立 利用Box－Behnken实验软件对表2实验数据进行回归分析，得二次多元回归模型为:

表2 Box－Behnken实验设计与结果

2.5.2 方差分析和显著性检验 以上拟合方程的相关系数说明设计模型拟合程度良好，可以用此模型对AC脂质体的处方进行分析和预测。从r2来看，3个指标均以二项式拟合度较优。3个考察指标中包封率和粒径与自变量之间呈显著相关性。从表3回归系数的显著性检验可知，模型(1)中X1(P＜0.000 1)、X2(P=0.000 1)项极显著，其他项不显著;模型(2)中X2(P=0.000 5)、X22(P=0.003 9)显著，其他项不显著;模型(3)中X1(P＜0.000 1)、X12(P=0.000 1)显著，其他项不显著。

表3 回归方程中的显著性系数

表4 按照最优处方制备的牛蒡苷pH敏感脂质体实验观察值与模型预测值

2.5.3 效应面优化与预测 按照二项式拟合方程描绘效应对各因素的效应面，本试验欲控制纳米粒径在＜200 nm范围内，并取得较高的收率和包封率。根据上述分析的结果，效应面优化与预测应用实验设计软件绘制各指标与影响较显著的2个自变量的三维曲面图(另一自变量设为中心点值，图2)，设计各指标权重，得到优化后处方(X1=4.36，X2= 10.01，X3=1.32)。按此处方制备了3批脂质体，其包封率、载药量和粒径见表4。从表4可知，实验观察值和模型预测值都比较接近，模型的预测性良好。

图2 考察因素与评价标准效应曲面图

2.6 AC脂质体稳定性考察

2.6.1 性状 本品为均匀，细腻，黏稠的乳白色液体。

2.6.2 pH值 取本品5.0g，加100 mL蒸馏水稀释，搅拌5 min，测定pH值在6.0～7.0之间。

2.6.3 稳定性实验 a.将脂质体装入无菌安瓿中，封口，分别在冰箱(4℃)、室温(22℃)和60℃下放置24 h，观察其性状并测定包封率;b.将脂质体装入无菌安瓿中，封口，给与光照24 h，测包封率;c.将脂质体装入无菌安瓿中，封口，分别在室温下放置一周、两周、一个月，测包封率结果:脂质体在冰箱和室温下可以稳定保存，室温下保存一个月后包封率基本没有变化，说明该法制得的脂质体性质稳定不易泄漏;而对于光照和60℃条件表现出不稳定性。

2.7 形态学观察(TEM) 取适量牛蒡苷pH敏感脂质体溶液滴在喷碳铜网表面，使液体尽量铺满整个铜网，以质量分数2.0%磷钨酸负染3 min后，于透射电镜下观察形态。从图3可以看出，牛蒡苷pH敏感脂质体为球形或类球形粒子，大小均一，结构完整。

图3 透射电镜下牛蒡苷pH敏感脂质体形态学

3 讨论

3.1 在脂质体单因素(磷脂－胆固醇比(X1)、磷脂－药质量比(X2)、pH敏感材料含量(X3))考察过程中发现，影响脂质体性质的因素主要是磷脂－胆固醇比(X1)、及磷脂－药质量比(X2)。因此以这3个因素为考察对象，以包封率、载药量及粒径为考察指标进行Box－Behnken实验设计。

3.2 根据实验研究发现，影响包封率和载药量的最主要因素为磷脂－胆固醇比(X1)和磷脂－药质量比(X2)，根据图2中的图A和B可知，包封率和载药量随着磷脂－胆固醇比的增大呈先增大后减小的趋势，原因可能为磷脂质量浓度增加，形成的脂质体增多，其粒径也增大，包封在脂质体内药物相应增多，因而能包载更多药物及药物胶束，包封率相应提高，同时载药量也相应增大。但是磷脂质量浓度过大，相同投药量下的载药量下降，而且形成的脂质体容易聚集融合，导致药物泄漏，使得载药量和包封率降低。

3.3 由图2中图C可知，脂质体粒径大小受磷脂－胆固醇比(X1)影响最大，而磷脂－药质量比(X2)影响较小，粒径随着磷脂量的增多而增大。

3.4 pH敏感材料含量(X3)对脂质体的包封率、载药量和粒径的影响都较小，根据参考文献［2～4］可知，以该材料修饰合成的脂质体在体内可表现良好的pH敏感性，为后期进行pH敏感脂质体体内研究奠定基础。

4 结论

本实验通过Box－Behnken效应面设计法优化了牛蒡苷脂质体的处方，按此处方制备了3批脂质体，包封率、载药量和粒径实测值与预测值的偏差均较小，说明该方法预测性能较好，可以准确的优化牛蒡苷脂质体的处方;通过对优化后脂质体处方的粒径测定结果可知，含有pH敏感材料的脂质体粒径均在228 nm左右，通过透射电子显微镜观察，脂质体大小分布均匀，结构完整，为下一步的体内研究奠定了良好基础。

［1］ Shin J，Shum P，Thompson DH.Acid－triggered release via dePEGylation of DOPE liposomes containing acid－labile vinyl ether PEG－lipids［J］.J Control Release，2003，91(1－2):187－200.

［2］ Chen D，Jiang X，Huang Y，et al.pH－Sensitive mPEGHz－Cholesterol Conjugates as a Liposome Delivery System［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2010，25(5):5527－5542.

［3］ Chen D，Jiang X，Liu J，et al.In vivo evaluation of novel pH－sensitive mPEG－Hz－Chol conjugate in liposomes: pharmacokinetics，tissue distribution，efficacy assessment［J］.Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol，2010，38(3):136－142.

［4］ Liu J，Li H，Chen D，et al.In vivo evaluation of novel chitosan graft polymeric micelles for delivery of paclitaxel［J］.Drug Deliv，2011，18(3):181－189.

［5］ 王潞，赵烽，刘珂.牛蒡子苷及牛蒡子苷元的药理作用研究进展［J］.中草药，2008，39(3):467－470.

［6］ 徐朝晖，李婷，邓毅，等.牛蒡子提取物的降血糖作用［J］.中草药，2005，36(7):1043－1045.

［7］ 徐传芬，孙隆儒.牛蒡的研究现状.天然产物研究与开发，2005，17(6):818－821.

［8］ 王劲，杨松松.牛蒡子抗病毒有效部位研究［D］.沈阳:辽宁中医学院，2004.

［9］ 邢传峰，胡海洋，杨春荣.Box－Behnken效应面法优化长春西汀长循环脂质体处方［J］.沈阳药科大学学报，2009，10(26):761－766.

［10］ 阎婷，王佩琪，郭伟英.紫外分光光度法测定牛蒡子提取物总木脂素含量［J］.沈阳药科大学学报，2009，30 (1):63－64.