启动子区域甲基化状态对THP－1细胞肿瘤坏死因子α分泌的影响

郭 尧， 杨智勇， 王春友

(华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺病研究所，湖北武汉430022)

肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF－α)最早于1975年被发现，是由活化的单核细胞产生的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质［1］。在对TNF－α研究后发现，TNF－α是一种重要的炎症因子，促进炎症的发生和发展［2］。在多种因素的刺激作用下，TNF－α可以快速地表达分泌，在数小时后就可以达到分泌高峰水平［3，4］。TNF－α的表达调控是一个复杂的过程，包括转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后水平等等［5］。脊椎动物DNA甲基化最显著的特征是在基因组的某些区域内，富含密度较高的CpG双核苷酸结构，即CpG岛［6］。CpG岛结构广泛存在于各种组织细胞基因中，在基因表达调控中起着重要作用［7］。TNF－α基因启动子区域无典型CpG岛结构，但有散在的CpG双核苷酸，这些CpG双核苷酸结构与核因子κB(nuclear factorκB，NF－κB)、cAMP应答元件(cyclic AMP response element，CRE)、AP－1、Sp1、AP －2等一些重要的转录因子结合位点相邻或关系密切［8］。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激人单核细胞系THP－1细胞，对不同时点TNF－α表达水平与其基因启动子区域甲基化状态进行了研究，探讨TNF－α基因启动子区域散在CpG双核苷酸结构的甲基化状态与基因表达调控之间的关系。

材料和方法

1 材料

人单核细胞系THP－1细胞购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。RPMI－1640液体培养基购于Gibco，4℃保存。胎牛血清购于Gibco，－20℃保存。LPS购于Sigma。TNF－α酶联免疫分析(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购于武汉博士德公司。DNA提取试剂盒购于Promega。甲基化转化试剂盒购于Qiagen。DNA纯化回收试剂盒购于TaKaRa。

2 方法

2.1 细胞培养 THP－1细胞在含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液中，置于含5%CO2、37℃培养箱中培养。细胞培养至对数生长期时开始用于实验。

2.2 TNF－α分泌峰值测定 使用终浓度为1 mg/L LPS刺激不同样本THP－1细胞，每个样本的细胞浓度为1.0 × 109cells/L。分别刺激 0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h。收集细胞培养液，以 1 000 r/min离心5 min，取上清液，通过ELISA方法测定TNF－α蛋白分泌量，每个样本做双份测定。实验重复4次，结果以刺激不同时间的分泌量与未刺激时分泌量比值的均数±标准误(±sE)表示。使用方差分析对不同时间点分泌量进行统计学评估。

2.3 DNA甲基化转化 将培养细胞分为3组。对照组:细胞不使用任何炎症介质刺激。1 mg/L LPS(4 h)组:细胞使用1 mg/L LPS刺激4 h。1 mg/L LPS(8 h)组:细胞使用1 mg/L LPS刺激8 h。刺激时间结束后，使用DNA提取试剂盒，分别从每组细胞中提取基因组DNA。提取的DNA采用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。使用甲基化转化试剂盒，对所提取基因组DNA进行甲基化转化。该试剂盒采用重亚硫酸盐转化法。转化后分别纯化回收每组样本DNA。

2.4 PCR扩增 分别对每组甲基化转化后的基因组DNA进行PCR扩增。针对TNF－α启动子区域设计甲基化PCR扩增引物。正向引物5＇－ccaaaagaaatggaggcaatag－ 3＇，逆向引物 5＇－ gaccagctaagagggagagaag－3＇。扩增产物为启动子区域－344到+57位点。PCR扩增后，对其进行琼脂糖凝胶电泳。使用DNA纯化回收试剂盒对凝胶电泳后每组DNA片段分别进行纯化回收。

2.5 转化及筛选 将纯化回收的甲基化转化后DNA片段通过TA连接进入T载体，连接后将载体转化到感受态细菌，接种于新制含氨苄西林、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(5－bromo－4－chloro－3－indolyl－β－D－galactopyranoside，X－gal)和异丙基硫代－β－D－半乳糖苷(isopropyl β－D－thiogalactoside，IPTG)的LB琼脂培养板，于37℃恒温培养箱中培养。24 h后取出培养板，挑选单克隆白色菌落再次接种于新制LB琼脂培养板，于37℃恒温培养箱中培养。24 h后挑选单克隆白色菌落于LB液体培养基中摇菌过夜。

2.6 基因测序 细菌培养后，送新鲜菌液进行DNA测序。每组样本选取5个克隆送Invitrogen公司测序。每组样本测序结果以CpG双核苷酸结构甲基化数占扩增区域总CpG双核苷酸结构数的百分率表示。采用χ2检验比较间差异。

结 果

1 LPS刺激下THP－1细胞TNF－α的表达变化

使用终浓度为1 mg/L LPS刺激THP－1细胞。培养液上清TNF－α分泌水平在刺激后2 h明显升高。刺激4 h达到分泌高峰，浓度为未刺激时的(48.9±1.06)倍，与未刺激时相比明显升高(P＜0.01)。4 h后开始下降，刺激8 h有明显降低，浓度为未刺激时的(36.30±1.65)倍，与刺激4 h时相比明显下降(P＜0.01)，见图1。各组甲基化率与相应时点TNF－α分泌量比值之间呈明显负相关(r=－0.99，P＜0.01)。

Figure 1.The secretion level of TNF－α in LPS－stitmulatedTHP－1 cells.THP －1 cells were stimulated with 1mg/L LPS for the indicated time.The data were presented as ratios relative to unstimulated cells(0 h).±sE.n=4.＊＊P ＜0.01 vs 0 h;△△P ＜0.01 vs 4 h.图1 LPS刺激下THP－1细胞培养液上清TNF－α浓度的变化

2 TNF－α基因启动子区域DNA甲基化分析

基因测序结果表明，未受LPS刺激的THP－1细胞，其TNF－α基因启动子－344 bp到转录起始位点(transcription start site，TSS)区域内，11个CpG双核苷酸结构均处于甲基化状态，见图2B。1 mg/L LPS刺激4 h后，TNF－α基因启动子－344 bp到TSS区域内11个CpG双核苷酸结构中，仅有4个仍处于甲基化状态。其中－119、－72、－49、－38等几个与转录因子(transcription factor，TF)结合位点相邻或关系密切的位点，其CpG双核苷酸结构已去甲基化，见图2C。1 mg/L LPS刺激8 h后，该区域内11个CpG双核苷酸结构中，有9个处于甲基化状态。其中－238、－169、－163、－161、－119、－72、－49等几个位点开始恢复甲基化状态，－146和－38位点处于去甲基化状态。－119、－72、－49等几个与TF结合位点相邻或关系密切的位点，其CpG双核苷酸处于甲基化状态，见图2D。

Figure 2.The TNF － α promoter fragment ranging from －344 bp to TSS was analyzed by bisulfite sequencing.Filled black circles represent≥80%methylation at a given CpG after sequencing 5 individual clones.Open circles represent＜20%methylation at a given CpG.Half－filled black circles represent between 20%and 80%methylation at a given CpG.A:the fragment contains 11 CpG dinucleotides(arrow:↑)and the TF binding sites for AP －1，AP －2，Sp1，NF － κB as well as cAMP response element(CRE)and TATA box;B:methylation status of gene promoter in unstimulated THP－1 cells;C:methylation status of gene promoter in 4 h LPS－stimulated THP－1 cells;D:methylation status of gene promoter in 8 h LPS－stimulated THP－1 cells.图2 TNF－α基因启动子－344 bp到TSS区域甲基化状态

TNF－α基因启动子区域测序结果表明，CpG双核苷酸结构平均甲基化率，对照组为100%;1 mg/L LPS(4 h)组为21.8%;两者之间差异显著(P＜0.01)。CpG双核苷酸结构平均甲基化率，1 mg/L LPS(8 h)组为41.8%，与1 mg/L LPS(4 h)组之间差异显著(P＜0.05)。

讨 论

基因序列中存在的CpG双核苷酸结构，其甲基化状态对基因的表达调控有重要作用［5，8，9］。脊椎动物DNA甲基化最显著的特征是富含CpG岛，即在基因组的某些区域内，富含密度较高的CpG双核苷酸结构［6］。DNA甲基化影响基因表达的一个机制是甲基化CpG结构直接影响TF与启动子区域结合，从而抑制转录［10］。查找TNF－α基因序列，发现其启动子区域无典型CpG岛结构。此次实验采用基因测序法研究TNF－α基因启动子－344 bp到+57 bp区域，其中－344 bp到TSS区域内含11个散在的CpG双核苷酸结构。此区域内还含有NF－κB、CRE、AP－1、Sp1、AP－2等关键 TF结合位点，见图 2A。其中，－119、－72、－49、－38等几个位点的 CpG 双核苷酸结构与这些TF结合位点相邻或关系密切。因此此区域DNA甲基化状态可能在TNF－α的表达调控中起着重要作用。

目前，对DNA甲基化的研究方法主要有甲基化特异性PCR法、限制性内切酶甲基化分析法、重亚硫酸盐甲基化测序法等，其中以重亚硫酸盐测序法最为可靠和直观［11］。本次实验采用重亚硫酸盐转化基因测序法对LPS刺激的THP－1细胞进行研究。

本研究测定的THP－1细胞TNF－α基因启动子区域含有11个CpG双核苷酸结构，未受刺激时均处于甲基化状态。在受到LPS刺激后，TNF－α分泌在4 h达到高峰。此时，所测序的5个克隆中，甲基化率达到或高于80%的位点只有1个，甲基化率介于20%到80%之间的只有3个，其余均处于去甲基化状态，整体甲基化水平最低，提示TNF－α基因表达增高与其启动子区域去甲基化状态有关。在LPS刺激8 h后，TNF－α分泌已开始降低，其基因启动子区域的11个CpG双核苷酸结构已开始部分恢复甲基化状态，甲基化率达到或高于20%的位点有9个，其中甲基化率达到或高于80%的有2个，只有2个位点为去甲基化状态，1个位点继续保持去甲基化。

总体上来看，当TNF－α基因启动子区域散在的CpG双核苷酸结构甲基化水平较高时，基因不表达或低表达;当其甲基化水平较低时，基因高表达。TNF－α分泌量与TNF－α启动子区域整体甲基化水平呈明显负相关。从每一个CpG双核苷酸位点情况来看，－238、－169、－163、－161、－119、－72和－49这几个位点的甲基化率与TNF－α分泌量相关性和整体水平一致。－119、－72和－49位点与部分重要TF结合位点相邻或关系密切，因此可能通过影响 TF与启动子区域结合，从而抑制转录。而－303、－146和－38这3个位点甲基化率与TNF－α分泌量无明显相关性，其机制值得进一步研究。

TNF－α是参与炎症反应的重要因子。TNF－α通过刺激血管内皮细胞表达黏附分子，使之易黏附于白细胞，刺激免疫细胞产生趋化因子，引起白细胞在炎症部位聚集，产生炎症反应［12］。TNF－α基因的表达，受多种因素的调控。近年来对TNF－α基因的表达调控研究较多的，是各种炎症介质的影响，以及各种信号转导通路的作用［3，4］。当细胞受到内毒素或其它一些炎症介质刺激时，相关转录因子与TNF－α基因启动子区域特异性位点结合，使TNF－α基因转录开始或上调，表达TNF－α［13］。除基因本身的改变外，表观遗传方式对TNF－α的表达调控作用还并不十分清楚。此次实验结果显示，不同TNF－α表达水平与其基因启动子区域甲基化水平具有负相关性。TNF－α基因启动子区域的甲基化状态是否直接导致基因表达的改变，如果直接导致其改变又是通过何种具体机制影响基因的表达值得进一步研究。

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