HPLC同时测定没食子中没食子酸与没食子酸甲酯的含量

秦冬梅， 胡利萍， 张跃新

(1石河子大学药学院，新疆石河子832002;2.新疆医科大学第一附属医院感染科，新疆乌鲁木齐830054)

没食子(Turkish galls)为壳斗科植物没食子树Quercus infectoria Oliv幼枝上的干燥虫瘿，由没食子蜂科昆虫没食子蜂Cynips gallae-tinctoriae Oliv.幼虫寄生而形成。没食子是维吾尔医常用药，没食子中含有大量的可水解鞣质，具有固涩、收敛、燥湿、止血、消炎的作用［1］。没食子鞣质多数为无定形粉末，并且具有较多的邻位酚羟基，易被氧化，因此，很难获得单体。从没食子鞣质中分离得到了单体鞣质没食子酸与没食子酸甲酯，故制订了高效液相法同时测定没食子酸与食子酸甲酯的含量，以控制药品质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试药

Waters液相色谱仪;DK-S26型电热恒温［水浴锅(上海精密实验设备有限公司);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);单盘光电分析天平(北京光学仪器厂，d:0.01 mg);实验用植物购于新疆参茸药业有限公司，品种鉴定由新疆石河子大学药学院中药系完成，没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:831-9501);没食子酸甲酯对照品(自制)，经鉴定纯度达99.42%，其 H-NMR、13C-NMR、UV、IR和ESI-MS数据与文献［2］对照一致。甲醇为色谱纯，水为重蒸水，磷酸(分析纯)，甲醇(分析纯)。

1.2 色谱条件［3］色谱柱:

YMC ODS-A C18柱(250 mm ×4.6 mm，S-5 μm，12 nm);检测波长:273 nm;流动相:乙腈-0.5%磷酸溶液(21∶79);流速:0.50 mL/min;柱温:25℃。理论板数按没食子酸甲酯峰计算为2 100，外标法。

2 方法和结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的配制 精密称取没食子酸对照品适量，用甲醇定容制成含没食子酸0.050 mg/mL，精密称取没食子酸甲酯对照品适量，用甲醇定容制成含没食子酸甲酯0.130 0 mg/mL的溶液。

2.1.2 供试品溶液的配制［4］取本品研细，精密称取适量(约1 g)，置于棕色具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，超声提取30 min，放冷致室温，过微孔滤膜(0.45 μm)，即得。

2.2 系统适应性试验

分别取对照品溶液、样品溶液注入色谱仪，按1.2项下色谱条件进样，1号峰为没食子酸，2号峰为没食子酸甲酯，结果见图1。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线的制备 精密吸取浓度为0.050 0 mg/mL没食子酸与0.130 0 mg/mL的没食子酸甲酯对照品溶液，进样量分别为0.5、2、5、8、10 μL，在上述色谱条件下进样，以峰面积积分值(A)对进样量(μg)绘制标准曲线，没食子酸与没食子酸甲酯分别得回归方程y=3 697 526x-9 965 r=0.999 6;y=4 434 792x-14 628 r=0.999 2，没食子酸在0.050 6～0.406 0 μg范围内峰面积值(y)对进样量(x)有良好线性关系，没食子酸甲酯在0.116～1.044 μg范围内，峰面积值(y)对进样量(x)有良好线性关系。

图1 对照品(A)、供试品(B)色谱图

2.3.2 精密度试验 精密吸取上述没食子酸与没食子酸甲酯对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下，按1.2项下色谱条件连续进样5次，计算含量的RSD分别为0.84%，1.05%;供试液分别连续5d测定没食子酸与没食子酸甲酯含量，计算含量的RSD分为0.95%，1.08%。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一样品溶液10 μL，分别在 0、2、4、6、8、10 h 进样，试验结果表明样品溶液在 10 h 内稳定性良好，没食子酸与没食子酸甲酯的 RSD分别为1.09%，1.62%。

2.3.4 重复性试验 对同一批样品，6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，测峰面积，并计算没食子酸与没食子酸甲酯含量。没食子酸平均含量为9.52 mg/mL，RSD为0.96%，没食子酸甲酯平均含量为2.76 mg/mL，RSD为0.71%。

2.3.5 加样回收率试验采用加样回收法。分别称取已知含量的供试品9份，采用标准添加法精密加入对照品溶液，制备高、中、低3个浓度的溶液，依条件进行测定，计算各组分的回收率。没食子酸的平均回收率为98.8%，RSD为1.50%，没食子酸甲酯的平均回收率为98.50%，RSD为1.26%。见表1。

2.4 样品含量测定

按2.1.2项下处理方法配置，依上述方法分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，以外标法计算样品中没食子酸与没食子酸甲酯含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 以流动相作溶剂，在200～400 nm波长范围内测定了没食子酸紫外光谱图，结果在273 nm处有最大吸收，确定273 nm为测定波长。

3.2 溶剂的选择 本实验比较了没食子酸在甲醇与水中的稳定性［5-7］，结果没食子酸甲酯在甲醇中8h内稳定，在水中不稳定，故选用甲醇为溶剂。

表1 回收率试验结果

表2 没食子酸与没食子酸甲酯含量测定结果(n=3)

3.3 提取方式以及提取时间的选择 实验中考察了不同提取方式(加热回流和超声提取)、不同提取时间(30、45、60 min)。结果表明，精密加入甲醇25 mL超声处理30 min，可将样品中的没食子酸提取完全［8-10］。

3.4 建立了测定没食子中没食子酸与没食子酸甲酯的高效液相色谱法，该方法可作为测定药材和制剂中没食子酸与没食子酸甲酯含量的方法［9-10］，可作为其质量控制指标之一。

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