蒲公英中有机酸类成分的提取工艺研究

李喜凤， 郝 哲， 邱天宝， 许 闽， 余云辉， 杜云锋

(1.河南中医学院，河南郑州450008;2.中国人民解放军第一五三中心医院药械科，河南郑州450042)

蒲公英 Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.为临床常用中药，有清热解毒，消肿散结，利尿通淋之功效。蒲公英含有多种活性成分，如黄酮类，皂苷类，有机酸类，多糖等。其中咖啡酸和绿原酸具有明显的抑菌作用，阿魏酸具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化等药理作用［1］。目前对于蒲公英药材及其制剂提取工艺的研究较少［2-7］，本实验采用正交设计试验法以咖啡酸、绿原酸、阿魏酸的含量为考察指标，用高效毛细管电泳法［8-14］进行测定，筛选出了蒲公英中3种有机酸成分的最佳提取工艺。

1 仪器和试剂

1.1 仪器 美国Beckman公司P/ACETMMDQ毛细管电泳仪，DAD检测器 ，Karat 32系统软件，未涂层石英毛细管柱(75 μm ID×50/57 cm，分离长度/总长，河北永年锐沣色谱器件有限公司)，PHS-2SB型数字酸度计(上海大谱仪器有限公司)，YUEPINGFA2004b型电子天平(上海越平科学仪器有限公司)。

1.2 试药 蒲公英药材采于河南省不同地区，经河南中医学院生药学科陈随清教授鉴定均为菊科植物蒲公英T.mongolicum Hand-Mazz的干燥全草。咖啡酸对照品(批号:110885-200102)，绿原酸对照品(批号:110753-200413)，阿魏酸对照品(批号:0773-9809)均由中国药品生物制品检定所提供。水为娃哈哈纯净水，所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 电泳条件 电压18 KV;压力进样0.5 psi;进样时间5 s;检测波长325 nm;温度25℃;硼砂浓度20 mmol/L(1 mol/L NaOH调pH 9.55)。

2.2 毛细管预处理 实验前依次用NaOH(0.1 mol/L)溶液、水、缓冲液依次冲洗10、10、20 min，进样前分别用NaOH(0.1 mol/L)溶液、水、缓冲液依次冲洗3、2、3 min。实验结束后用 NaOH(0.1 mol/L)溶液、水冲洗10 min。所用溶液进样前均用0.45 μm的滤膜过滤，并超声脱气3 min。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取咖啡酸、绿原酸、阿魏酸对照品适量加70%甲醇溶解并制成浓度为0.097 6、0.084 8、0.005 4 mg/mL 的溶液，摇匀，作为对照品贮备液，见图1。

2.4 供试品溶液的制备 取蒲公英细粉1 g，精密称定，按L9(34)工作表制备样品溶液，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL使溶解，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇萃取4次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用70%甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得，见图2。

图2 供试品HPCE图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密量取咖啡酸、绿原酸、阿魏酸混合对照品溶液 1、2、4、6、8 mL分别置 10 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，摇匀。按2.1项下条件进样，测定各组分的峰面积，以浓度X(mg/mL)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标计算回归方程:咖啡酸的回归方程为Y=1×106X-1 115，r=0.999 8，线性范围为:0.009 76～0.078 08 mg/mL;绿原酸的回归方程为Y=48 894X-1 387.3，r=0.999 8，线性范围为:0.008 48～0.067 84 mg/mL;阿魏酸的回归方程为Y=791 926X-78.689，r=0.999 9，线性范围为:0.000 54～0.004 32 mg/mL。

2.5.2 精密度试验 精密吸取同一咖啡酸、绿原酸、阿魏酸混合对照品溶液，在上述分离条件下重复进样5次，其峰面积的RSD分别为1.8%、1.9%、1.6%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批蒲公英样品5份，按下述正交试验最佳提取工艺制备供试品溶液，测得咖啡酸峰面积的RSD为1.7%，绿原酸峰面积的RSD为1.23%，阿魏酸峰面积的RSD为1.9%。

2.5.4 稳定性试验 取上述样品溶液，每隔2 h进样，连续10 h，结果咖啡酸峰面积的 RSD为1.7%，绿原酸的峰面积的RSD为1.7%，阿魏酸峰面积的RSD为1.8%。表明咖啡酸、绿原酸、阿魏酸在10 h内基本稳定。

2.5.5 加样回收率试验 精密称取已知咖啡酸、绿原酸、阿魏酸含量的蒲公英样品9份，分别按80%、100%、120%三个浓度精密加入对照品溶液适量，制备供试品溶液，结果显示咖啡酸、绿原酸、阿魏酸的平均回收率为97.71%、97.96%、98.24%;RSD值为1.05%、1.44%、0.96%。

2.6 单因素提取工艺筛选试验及结果

2.6.1 乙醇浓度的影响 准确称量蒲公英粗粉1 g共6份，3组，每组实验重复2次，分别加60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇20 mL水浴回流1.5 h，按2.1项下电泳条件进样，分别测定咖啡酸、绿原酸及阿魏酸的含量，结果显示80%乙醇提取效果较好，见图3。

2.6.2 回流时间的影响 准确称量蒲公英粗粉1 g共6份，3组，每组实验重复2次，分别加80%乙醇20 mL 水浴回流0.5、1、1.5、2、2.5 h，分别测定咖啡酸、绿原酸及阿魏酸的含量，结果显示回流2 h效果最佳，见图4。

图3 乙醇浓度的影响

图4 回流时间的影响

2.6.3 溶剂量的影响 准确称量蒲公英粗粉1 g共6份，3组，每组实验重复2次，分别加80%乙醇10、20、30、40、50 mL，水浴回流 2 h，分别测定咖啡酸、绿原酸及阿魏酸及的含量，结果显示溶剂量为40 mL提取效果较好，见图5。

2.6.4 提取次数的影响 准确称量蒲公英粗粉1 g共6份，3组，每组实验重复2次，分别加80%乙醇20 mL水浴回流，3组分别提取1次、2次、3次，每次2 h，分别测定咖啡酸、绿原酸及阿魏酸的含量，结果差别不大，故选择提取1次为宜。

图5 料液比的影响

2.6.5 不同药材粒度的影响 准确称量不同粒度的蒲公英粉末(粗粉、50目、65目、120目)1 g共8份，4组，每组实验重复2次，分别加80%乙醇20 mL水浴回流2 h，分别测定咖啡酸、绿原酸、阿魏酸的含量，结果显示药材粒度为50目较好，但相差不大，故不做为正交因素考察。

2.7 正交试验设计及结果 通过上述单因素试验确定3因素3水平作为正交试验的因素和水平，进一步确定最佳提取工艺。因素水平表见表1，L9(34)正交实验安排及结果，见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平表

表2 正交试验

由直观分析可知，影响提取效果的因素为:A(乙醇浓度)＞B(溶剂量)＞C(提取时间)，以乙醇浓度影响最大，溶剂量次之，提取时间影响最小。经方差分析可知:乙醇浓度对提取效果影响最显著，溶剂量对提取效果影响显著，提取时间对提取效果无显著性差异，为节约生产成本，确定最佳提取条件为A2B3C1。

2.8 验证试验 为进一步考察上述工艺的稳定可行性，精密称定蒲公英药材1 g，按优选工艺A2B3C1重复试验3次，结果见表4。

表3 方差分析表

表4 验证试验结果

结果表明，按优选的最佳提取工艺提取，有效成分提取效果好，表明该工艺合理稳定可行。

3 讨论

3.1 正交试验结果表明，蒲公英中有机酸的最佳提取条件为:80%乙醇，料液比为1∶40，水浴回流1.5 h，各有机酸的提取率均较高。

3.2 以多种有效成分为指标评价成分复杂的中药材，具有一定的科学合理性，本实验以蒲公英的主要有效成分咖啡酸、绿原酸、阿魏酸的含量为指标研究最佳提取工艺，同时根据各成分在药效中所起的作用赋予不同的权重系数综合评分进行评价，避免了对多指标单独评价时相互间的冲突。

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