小鼠胶原诱导性关节炎模型的建立及其免疫学变化研究

肖智勇，张令令，张小锐，周文霞，张永祥

(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)

实验性类风湿性关节炎动物模型为研究类风湿关节炎的病因、发病机制和治疗方法提供了有力的工具。理想的类风湿动物模型应该具备以下条件：(1)临床症状、病理和影像学的特点与人类RA相似；(2)尽可能少的具备非 RA的特点；(3)易感的动物品系容易得到且价格便宜；(4)动物可以高效繁殖；(5)可以缩短疾病的自然发生过程；(6)容易检测疾病和免疫功能的变化；(7)可以模拟类风湿性关节炎患者的治疗作用。目前类风湿性关节炎的动物模型有佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis，AA)、链球菌细胞壁成分(strepococcal cell wall fragments，SCW)诱导的关节炎、卵蛋白诱导的关节炎、蛋白多糖诱导的关节炎、降植烷(pristane)诱导的关节炎、胶原诱导的关节炎(collagen induced arthritis，CIA)、转基因动物模型等［1］。其中 CIA小鼠模型最为常用的模型。

CIA模型是Trentham等1977首次建立的实验性关节炎动物模型，是一种免疫性炎症模型，以多发性的末端关节炎为主要临床表现［2］。T细胞激活、细胞因子分泌和Ⅱ型胶原抗体等的产生是CIA发病的主要环节［3］。但是，目前鲜见Ⅱ型胶原诱导CIA模型的系统免疫学变化的报道。因此，本研究采用DBA/1小鼠诱导了CIA模型，并对其免疫学改变进行了系统研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：DBA1/J小鼠，三级，雄性，6～8周，华阜康生物技术有限公司提供［SCXK(京)2009-0004］。实验时饲养于温度(20±2)℃和湿度(55± 2)%相对较为恒定的动物饲养室，自由饮水，每日光照/黑暗各12h。

1.1.2 药品及试剂：完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)、牛Ⅱ型胶原(CⅡ)，Chondrex公司，美国。刀豆蛋白 A(concanavalin A，Con A)sigma公司，美国。Lum inex细胞因子试剂盒，Millpore公司，德国；αLISA试剂盒，Perkin Elmer公司，美国。辣根过氧化酶(horseradish peroxidase， HRP)标记的羊抗小鼠IgG，Santacruz公司，美国。

1.1.3 Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型小鼠的制备：将CⅡ溶于0.02mol/L的醋酸中2mg/mL，4℃过夜，将溶解的CⅡ与CFA等体积混和充分乳化(操作在冰上进行)，将乳化后的液体滴在水中后不扩散且成形，视为乳化完全。于DBA/1小鼠尾根靠后1-2cm处皮内注射100μL CⅡ与 CFA的混合乳剂(含CⅡ0.1μg)进行初次免疫，当天记为1d，到21d同样方法进行第二次免疫。

1.2 实验方法

1.2.1 CIA小鼠足爪肿胀测量：应用千分尺测量CIA模型小鼠的左右两侧足掌厚度，每周测一次。

1.2.2 关节炎评分：每3天一次评分，评分标准：0=无红斑或肿胀。1=轻微的红斑或一个趾的肿胀。2=红斑和超过一个趾的肿胀。3=红斑和踝部或腕部肿胀。4=全部红斑及脚趾和踝部或手指和腕部的肿胀，踝或腕不能弯曲。

1.2.3 Ⅱ型胶原特异性抗体的测定：将2mg/m L的CⅡ溶于 PPB缓冲液中，浓度为5μg/m L，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；5%FCS封闭酶联板4℃，30m in；将样品以1：10000～50000稀释后每孔100μL孵育4℃过夜，洗板3次后加100μL/孔二抗(2μg/m L)，4℃孵育至少2h，洗板6次后加入100μL TMB，室温孵育 15min，用 50μL/孔的2mol/L硫酸(终止液)/孔终止反应。读取OD450nm。

1.2.4 脾细胞培养上清中IL-17的测定：αLISA技术是基于增强化学发光的均相免疫检测技术，是在传统的ELISA技术基础上进行的改进，借助微珠进行生物分子检测，无需洗涤。参照说明书进行操作，5μL/孔标准品或空白对照或 CIA模型小鼠培养上清加入384微孔板，5μL/孔新鲜配制的2.5×抗IL-17受体磁珠和生物素化抗 IL-17抗体混合物(终浓度分别为 10μg/mL、1nM)；23℃，孵育，60m in，40μL/孔2×SA-Donor磁珠(终浓度为40μg/m L)，23℃，避光孵育，30m in；EnVison-Alpha Reader 2103上机检测，激发波长 680nm，发射波长615nm。

1.2.5 脾细胞培养上清TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-

4含量的测定［4］：应用 Luminex技术检测 CIA小鼠血清、脾细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-4含量。检测方法：细胞培养上清经10000rpm离心5m in进一步去除脂质、杂质等有形成分，暂置4℃保存待测。血清混匀，离心后4℃保存待测；参照说明书配置标准品和质控品；每孔200μL Wash buffer润湿微量滴定过滤板，密封后在摇板机上室温(20～25℃)振荡10m in；真空抽除清洗液，使用吸水垫或纸巾吸干板底的水分；在对应的孔中加入25μL标准物或质控液，Assy buffer作为0pg/m L标准物(背景)加入；在样品孔中加入25μL assy buffer；在背景，标准物和质控孔中加入25μL合适的血清基质；在对应的孔中加入25μL血清或培养上清样品；充分混合分别能与 TNF-α、IL-1β、IFN-γ和 IL-4结合的4种微球，在每孔中加25μL抗体珠(注意：添加抗体珠时需不时摇动以避免沉淀)；96孔板盖上盖子4℃摇动过夜；小心地真空抽除液体；每孔使用200μL清洗液洗板2次，真空抽除清洗液，使用吸水垫或纸巾吸干板底的水分；每孔加入25μL检测抗体；盖上盖子，在室温(20～25℃)摇动孵育1h (孵育后不要真空抽除)；加入25μL抗生物素蛋白链菌素-藻红素；盖上盖子，在室温(20～25℃)摇动孵育30min；小心地真空抽除全部液体，每孔使用200μL清洗液洗板2次，真空抽除清洗液；在所有孔中加入150μL鞘液。在摇板机上摇板5min以充分重悬抗体珠；使用Lum inexTM200读板。采集样品数据后，经MasterPlexTMQT软件分析生成标准曲线，并计算出每个样品中所含4种细胞因子的浓度。

1.3 数据处理和统计学分析

实验结果数据以“均数±标准差”表示，关节炎肿胀度的比较采用 SPSS v18.0软件进行具有一个重复测量的方差分析。两组间均数显著性检验采用成组t检验。

2 结果

2.1 CIA模型小鼠关节炎症状

CIA小鼠于造模后23d开始，陆续出现前肢、后肢的红肿、功能障碍，体重也有明显下降，但鼻、耳部肿胀不明显；发病率高达100%，且随着时间的延长其关节肿胀程度呈进行性加重(图1)。

图1 CIA小鼠的足爪关节炎症状。

2.1.1 CIA模型小鼠足爪肿胀度

CIA模型小鼠在免疫后27 d，左、右两侧足爪厚度开始出现不同程度的增加，并且随着造模时间呈进行性加重(图2)。

图2 CIA模型小鼠足爪肿胀度。(A)左侧、(B)右侧。＊＊P＜0.01，n=8

2.1.2 CIA模型小鼠关节炎评分

由于足爪厚度的测量仅方便于小鼠后肢的测量，我们采用关节炎评分从整体上观察CIA小鼠四肢的发病情况及严重程度。结果表明，自免疫后30

d开始，模型小鼠关节炎评分达8±1，较对照组明显升高。实验后期，多数模型小鼠出现踝部腕部肿胀、变形，不能弯曲，关节炎评分更为升高(图3)。

2.2 CIA模型小鼠脏器指数的变化

实验结束后取小鼠胸腺、脾脏称重，实验结果显示模型组小鼠脾脏指数较对照组明显升高，胸腺指数则无明显变化(表1)。

图3 CIA模型小鼠关节炎评分。＊＊P＜0.01，n=8

表1 CIA模型小鼠脏器指数的变化

2.3 CIA模型小鼠T细胞功能的变化

2.3.1 CIA模型小鼠T细胞增殖能力的变化

采用［3H］-TdR掺入法观察CIA小鼠脾细胞增殖反应的变化。结果表明，模型组脾细胞自发增殖的cpm值与正常对照组相比明显降低，但CII刺激的特异性T细胞增殖的cpm值有所升高(表2)。

表2 CIA模型小鼠T细胞增殖能力的变化

2.3.2 CIA模型小鼠脾细胞培养上清细胞因子的变化

CD4+T细胞(T helper，Th0)根据分泌细胞因子的不同可分为Th1、Th2和 Th17等细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫应答；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，可辅助B细胞分化和产生抗体，与体液免疫相关。Th0在 IL-6、TGF-β作用下分化为Th17，Th17主要分泌IL-17，等介导慢性炎症、器官移植免疫排斥、自身免疫疾病和肿瘤发生等。Th1/Th2细胞的平衡紊乱、Th17细胞活化被公认为RA发病的重要机制之一［5］。

应用Luminex液相芯片技术检测了CIA模型小鼠脾细胞培养上清Th1/Th2细胞因子分泌水平的变化。结果表明，Con A诱导的CIA模型小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值均较正常对照组明显升高。αLISA技术检测脾细胞培养上清IL-17含量，发现CIA模型小鼠脾细胞培养上清中IL-17含量与正常对照组比较无明显变化(表3)。

表3 CIA模型小鼠T细胞细胞因子分泌的改变

2.4 CIA模型小鼠巨噬细胞功能的变化

RA患者滑膜细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞可产生大量致炎性细胞因子如 TNF-α、IL-1β等，参与骨、关节损伤。本研究采用LPS诱导的小鼠脾细胞，Luminex技术检测脾细胞培养上清中 TNF-α和IL-1β水平，实验结果显示模型组 TNF-α和 IL-1β水平较正常对照组明显升高(表4)。

2.5 CIA模型小鼠抗体生成的动态变化

初次免疫后 5、7、9周采血，检测小鼠血清总IgG分泌水平变化情况。结果表明，正常对照组小鼠血清中未检测到CII特异性IgG，而CIA模型小鼠血清中CII特异性IgG明显升高(表5)。

表4 CIA模型小鼠巨噬细胞细胞因子分泌的改变

表5 CIA模型小鼠血清CII特异性IgG的变化

3 讨论

本研究采用 II型胶原和弗氏完全佐剂免疫DBA/1小鼠，成功诱导了小鼠类风湿性关节炎动物模型。该模型的特点是初次免疫约30天后，小鼠双侧足爪明显肿胀，关节炎评分升高，且随造模时间延长疾病呈进行性加重趋势。免疫学参数研究表明，模型小鼠脾脏指数增加，抗原特异性 T细胞活化，分泌大量炎性细胞因子如 IFN-γ、TNF-α和 IL-1β等。同时，还存在 B细胞的过度活化，血清 CII抗体表达水平显著升高。CIA小鼠的临床特征和免疫学参数的变化和人类具有较高的一致性，是 RA作用机制研究和药物研发的理想模型。

CIA的建立要用异源性(牛或鸡)II胶原(CII)分两次免疫易感动物如DBA/1小鼠，其机制主要包括以下方面：首先，与发病相关的CII抗原肽必须有核心肽段。CII是由三条1018个氨基酸的α链组成的同源三聚体，其中的CII 260～270段含有能结合MHCⅡ分子和被TCR识别的功能氨基酸，被称为RA或CIA发生的核心抗原肽段。该核心肽段在常温下容易降解，这也是在乳化胶原时为什么要求在4℃环境下进行操作的原因。近交系DBA/1是H-2q单倍型小鼠，H-2q对 CII核心肽段有较强的易感性，能产生较强的T细胞扩增，继而诱导 CIA产生。

其次，具备与CIA易感相关的MHCⅡ类分子。RA的易患性与HLA-DR和HLA-DQ的一些等位基因亚型密切相关，它们所表达的DR及DQ分子可以提呈CII 260-270等自身抗原肽，并识别特异性TCR，从而激活T细胞。鼠类对CIA的易患性同样与MHCⅡ类分子关系密切。小鼠IA基因与HLADQ同源，IE基因与HLA-DR基因同源。研究发现，IA分子β1链的多态性决定了CIA的易患性，IE分子也参与CIA病理过程的调节，与CIA的发生率和严重性有关。对IA、IE及DQ、DR的序列分析表明，无论人或小鼠，RA/CIA易患的等位基因亚型表达的MHCⅡ类分子β1链在70-74位氨基酸序列上多具有(QK/RRAA)的保守序列即所谓的共同表位(shared epitope)［6］。这些相邻氨基酸残基的侧链分子组成的空间结构，是抗原肽的关键结合部位。H-2q小鼠表达的MHC-Ⅱ类分子为IAq和IEq，其中识别提呈CII抗原的MHCⅡ类分子为IAq，所以IAq小鼠(如：DBA/1、B10.Q)常被用来制作 CIA动物模型［7］。

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［6］Gregersen PK，Silver J，W inchester RJ.The shared epitope hypothesis，an approach to understanding the molecular genetics of susceptibility to rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum.1987，30：1205-1213.

［7］Rosloniec EF，Whiffington KB，Brand DD，et al.Identification of MHC classⅡand TCR binding residues in the type II collagen immunodominant determinant mediating collagen-induced arthritis［J］.Cell Immunol.1996，172：21-22.