大蒜素联合索拉菲尼对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及机制

张玉碧 ，吕林华 ，吕立华

1.湖南省邵阳市中心医院血液肿瘤科，湖南邵阳 422000；2.中山大学附一院，广东广州 510080；3.邵阳医学高等专科学校药学系，湖南邵阳 422000

大蒜素是从大蒜球茎中提取的含硫化合物，具有强大的抗炎作用[1]，近年研究发现大蒜素具有防癌、抗癌的特点[2]。索拉菲尼（Sorafenib）是一种口服的多靶点、多激酶抑制剂，临床治疗肝癌疗效确切，是目前晚期肝细胞肝癌（HCC）的标准治疗药物。我们通过大蒜素联合索拉菲尼对人肝癌细胞HepG2增殖作用的影响，以期从大蒜素联合索拉菲尼对Bcl-2基因mRNA的影响来研究其抗肿瘤作用机制，为中药治疗肝癌寻找新的突破方法和途径。

1 材料与方法

1.1 仪器

ELX808酶标仪，美国Bio Tek公司产品。

1.2 细胞与试剂

HepG2细胞株；DMEM培养基（美国Hyclone）；小牛血清（杭州四季青公司）；二甲基亚枫（DMSO）；四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT美国 Sigma)；大蒜素 （邵阳医学高等专科学校药学系，0.5 mol/ml，乙醇法提取），索拉菲尼（德国拜耳公司）。BCL-2基因引物由宝泰克生物技术公司合成；RT-PCR kit（宝生公司）；PCR扩增仪 （Minicvcler M7 Research）。

1.3 方法与结果

1.3.1 细胞培养 将HepG2细胞培养在含量10%小牛血清的DMEM 培养基中， 培养条件：37℃、100%湿度、5%CO2、95%空气。每24 h换液1次。

1.3.2 MTT法检测HepG2细胞增殖 取对数生长的HepG2细胞，以5×103/孔的密度接种于96孔板，培养24 h后加入药物。 实验分组：大蒜素（2、4、8、16、32 mg/L）、大蒜素 8 mg/L+索拉非尼（8 μmol/L）联合用药组，另设不加药的对照组，作用于HepG2细胞。每个剂量设5个复孔，加药后分别培养24、48、72h 后每孔加入 MTT（5 mg/m1）10 L，继续培养 4 h。终止培养，弃上清，每孔加 150 μl DMSO，振荡 10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪（波长570 nm）测定各孔的OD值，计算各组药物对细胞增殖抑制率，抑制率（%）=1-实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.3.3 RT-PCR检测Bcl-2基因mRNA表达 取培养24 h后的HepG2细胞，以Trizol法提取总RNA。逆转录和PCR扩增按RT-PCR试剂盒说明书进行，PCR扩增体系为50 μl。Bcl-2、GAPDH的引物由宝泰克生物技术公司合成。Bcl-2 mRNA探 针 序 列 ：5＇-GGAGCGTCAACAGGGGATTG-3＇，5＇-GATGC CGGTC AGGTA CTCAG-3＇上游引物和下游引物务2 μl，Taq酶 2 U，与逆转录产物 cDNA混匀，瞬时离心；扩增条件：94℃ 2 min、92℃ 1 min、55℃ 45 s、72℃ 1 min。 GAPDH 的引物序列：5＇-ATCAC TGCCA CTCAG GAGTC-3＇，5＇-TGAGG GAGAT GCTCA GTGTT-3＇。GAPDH 的扩增条件：95℃ 5 min，94℃ 1 min，55℃ l min,74℃ l min，25 个循环，74℃延伸 10 min。PCR产物利用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。

2 结果

2.1 大蒜素联合索拉菲尼对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

加入大蒜素联合索拉菲尼后，与对照组相比，肝癌细胞存活率下降，不同浓度大蒜素对HepG2细胞增殖的抑制作用，呈现明显的时间-剂量依赖效应，见表1、图1。

表1 MTT法检测不同浓度大蒜素联合索拉菲尼对HepG2细胞增殖的抑制作用（OD值，n=6）

2.2 大蒜素联合索拉菲尼对Bcl-2 mRNA表达的影响

通过RT-PCR法检测HepG2细胞HepG2细胞Bcl-2 mRNA表达，HepG2细胞经大蒜素、索拉菲尼、大蒜素联合索拉菲尼作用后，以Trizol法提取总RNA，通过RT-PCR后，产物用2%琼脂糖凝胶电泳，Bcl-2基因扩增产物长度为304bp，GAPDH基因扩增产物长度为260bp。见图2。

3 讨论

原发性肝癌在我国发病率、死亡率都非常高，严重威胁了人民的健康和生命。索拉菲尼是目前治疗晚期HCC的公认的最有效的药物。大蒜素作为大蒜的主要有效成分，大蒜素对人肝癌HepG2细胞增殖具有抑制作用[3]，近年来成为抗肿瘤领域的研究热点。索拉菲尼为首个获准上市的多靶点靶向治疗药物，是一种新型多靶点信号转导抑制剂[4]，能诱导大鼠肝细胞癌形成过程中巨噬细胞和自然杀伤细胞的聚集[5]。索拉菲尼对体外人肝癌HepG2细胞具有明显的抑制作用，主要表现为抑制其增殖和促进其凋亡[6]。本实验研究大蒜素联合索拉菲尼对人肝癌HepG2细胞增殖和Bcl-2基因的mRNA表达，观察不同时间的作用结果。

本实验通过MTT法发现，大蒜素在浓度2~32 mg/L范围内对人肝癌HepG2细胞增殖呈时间-剂量依赖关系 （P＜0.05)。另外，大蒜素联合索拉菲尼降低了人肝癌HepG2细胞存活数目，表明大蒜素联合索拉菲尼对人肝癌细胞的增殖有抑制作用。

现代研究证实，肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致，促凋亡基因活性受抑制和抗凋亡基因被激活是导致肿瘤细胞凋亡被抑制而长期存活的主要原因[7]。Bcl-2基因是一种重要的抑制细胞凋亡的基因，广泛存在于各种肿瘤细胞中，抑制Bcl-2基因的表达可使众多种类的癌细胞进入凋亡，Bcl-2基因的高表达严重影响着肿瘤的发生、发展，并使肿瘤细胞对放疗和化疗产生抵抗。在肝癌、膀胱癌等癌症中均证实Bcl-2基因的过度表达提示患者预后差[8]。Bcl-2可导致DNA受损的细胞持续生存、突变产物聚集，从而促进肿瘤的发生、发展[9]，shRNA可致HepG-2细胞凋亡，并抑制Bcl-2的表达[10]。

RT-PCR实验结果证明大蒜素联合索拉菲尼作用24 h后Bcl-2基因mRNA表达水平随药物浓度降低而上升，提示能下调HepG2细胞Bcl-2基因mRNA表达水平，这可能是其诱导HepG2细胞凋亡的重要机制之一，其详细作用机制还需深入研究。

综上所述，大蒜素联合索拉菲尼对HepG2细胞的增殖抑制作用，对Bcl-2 mRNA表达的下调作用机制的阐明为肝癌治疗开辟了新的途径，值得临床广泛推广。

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