HPV感染、p16蛋白表达与宫颈病变关系的研究

赵 暘 杨向红* 罗秀波 徐 刚

（1 中国医科大学附属盛京医院病理科，辽宁 沈阳 110004；2 中国人民解放军第463医院病理科，辽宁 沈阳 110042）

国际癌症研究中心于2004年提出HPV感染是宫颈鳞癌和上皮内瘤变发生的必要因素；没有持续HPV感染，女性发生宫颈鳞癌的可能性几乎为零[1,2]。p16基因是一种细胞周期中的基本基因，直接参予细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞株中发现有p16的纯合子缺失，突变，认为p16是比p53更重要的一种新型抗癌基因[3]。宫颈癌发生过程中p16的表达与HPV的感染是否相关，以往研究存在争议，有待于进一步研究。本研究探讨临床患者HPV感染、p16蛋白表达与慢性宫颈炎、癌前病变及宫颈癌的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

取自2009年3月至2010年3月盛京医院妇产科门诊活检和住院手术切除的宫颈标本石蜡包埋组织130例，其中慢性宫颈炎25例，CINⅠ20例，CINⅡ27，CINⅢ31例，浸润癌27例（鳞状细胞癌），患者年龄21～65岁，平均40岁。

1.2 主要实验仪器及实验试剂

凯普HPV核酸扩增分型检测试剂盒、即用型鼠抗人p16单克隆抗体及二步法PV-9000试剂盒购自北京中杉金桥技术有限公司。

1.3 方法

所有患者在取组织标本前，取宫颈脱落细胞和分泌物，接受HPV检测。采用HybriMax通过样本DNA的提取、PCR扩增、导流杂交、酶标显色，均严格按照试剂盒说明书进行操作，肉眼观察判读结果。

免疫组织化学染色：用乳腺癌作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照，严格按试剂盒的说明书进行操作。结果判定：p16阳性表达定位在细胞核和细胞质，胞核或胞质出现棕黄色为染色阳性细胞。着色按阳性细胞所占百分比并参考着色强度确定分级如下：无明显阳性细胞为阴性（－），阳性细胞数＜25%为弱阳性（+），阳细胞数25%～50%为中度阳性（++），阳性细胞数＞50%为强阳性（+++），以“++～+++”为过度表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析，相关分析。

2 结 果

2.1 130例宫颈脱落细胞HPV分型检测结果

21种HPV亚型中，检出15种常见的HPV亚型（检出率为71.4%），从高到低前5种依次为HPV16（56.15%）、HPV33（10.00%）、HPV18（6.92%）、HPV58（5.38%）、HPV31（3.85%）。其余各基因型所占比例在0.77%～2.31%之间。

2.2 实验各组HPV感染情况

在130例宫颈病变中，HPV感染108例，感染率83.1%。各病变组的HPV感染率如下：慢性宫颈炎6/25（24%）；CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级及宫颈癌HPV感染率分别为18/20（90%）；27/27（100.0%）；31/31（100.0%）；27/27（100.0%）；HPV感染率随宫颈病变级别上升而升高（P＜0.05）。高危-HPV的感染率为宫颈炎组28%，CINⅠ组95%，CINⅡ/Ⅲ组、宫颈癌组100%。高危-HPV阳性率在宫颈癌和CIN各组明显高于慢性宫颈炎组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 实验各组p16的表达情况

见图1、2。

统计结果显示，p16阳性表达率随着病变程度的增加，阳性表达以中度阳性（++）～强阳性（+++）为主；在CINⅠ中为90%（18／20），在CINⅡ、CINⅢ中均100.0%表达，单因素方差分析结果，F值为54.651，P=0.000＜0.001，说明四种病征的p16不同表达水平有显著差异。

图1 p16在CINⅠ组织中的阳性表达，胞质胞核均着色，p16阳性的细胞主要位于基底细胞层(IHC×200)

图2 p16在CINⅢ的阳性表达，病变细胞胞质和胞核均着色，上皮全层连续性着色。（IHC×200）

2.4 CIN组和宫颈癌组p16蛋白表达与HPV感染的关系

在子宫颈癌及CIN标本中，HPV16阳性率越高，p16的表达强度越高，HPV16感染与p16的表达呈正相关（r=0.998）。见表1。

表1 HPV16感染与p16表达程度之间的关系

3 讨 论

Zur Hausen于20世纪70年代末提出人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）可能与宫颈癌发病有关[4]，国际癌症研究中心于2004年提出HPV感染是宫颈鳞癌和上皮内瘤变发生的必要因素；没有持续HPV感染，女性发生宫颈鳞癌的可能性几乎为零。人乳头状瘤病毒（HPV）与宫颈癌关系的明确，使宫颈癌成为目前所有癌症中唯一一种病因明确、可以早期预防和治疗以及彻底根除的癌症。文献报告HPV感染基因亚型分布有地域性，各地报道不一。我们通过对130例宫颈病变患者HPV的分型筛查，发现该人群常见HPV亚型是HPV16、33、18、58和31型5种，这种差异可能与复杂的地理环境、社会生物因素或宿主的遗传免疫因素有关，值得在CIN和宫颈癌的防治策略中考虑，对宫颈癌疫苗的研制及应用有指导意义。

一般认为，90%以上的HPV感染在无任何干预的情况下可自行消退，仅有5%～10%发展为持续性的感染，只有高危型HPV的持续感染才与宫颈癌的发生有关。本研究在慢性宫颈炎组中，高危-HPV感染率为28%，在CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中，高危-HPV感染率分别为95%，100%和100%；高危-HPV感染率随着宫颈病变级别增加，阳性率增高。HPV感染是导致宫颈癌发病的主要原因，本研究数据再次证实了这个观点。

近年以来，绝大多数学者的研究认为p16可以作为宫颈上皮细胞异型的一个标志物。如Connor认为p16可以作为宫颈癌前病变的标志物[5]；Kalof等也认为p16对于诊断CIN是一个非常有用的标志物[6]；Kales等及Sayed等的研究认为当p16免疫组化染色用于CIN的辅助诊断时，能够降低观察者之间的差异，对于提高病理学家之间诊断的一致性具有重要的作用[7,8]。本次研究，在108例HPV-DNA阳性病例中，p16蛋白阳性表达率92.3%，且随着宫颈各组病变的HPV-DNA检出率逐渐升高，p16蛋白阳性表达亦逐渐升高。可以看出，p16作为宫颈癌和其癌前病变的诊断性标志及预后是很有应用前景的。

自从1998年Sano等[9]提出p16可以作为宫颈上皮内病变的一个诊断标志物用于临床病理诊断工作之中后，大部分学者的研究报道指出，p16散在点状弱阳性常预示低危型HPV感染的低级别CIN，而p16弥漫性或带状强阳性表达则预示高危型HPV感染的高级别CIN[10-12]。本次研究，在108例HPV-DNA阳性病例中，p16蛋白阳性表达率92.3%，且随着宫颈各组病变的HPV-DNA检出率逐渐升高，p16蛋白阳性表达亦逐渐升高。HPV感染与p16蛋白表达呈正相关关系。推测p16的高表达预示着高危HPV的感染，这就为临床的综合诊断及早期治疗提供了依据。

综上所述，HPV持续感染是引发宫颈病变重要病原学因素；p16蛋白表达的强度与CIN的分级明显相关，可以区分低、高度CIN，因此，可以考虑将HPV病毒检测以及分子标志物p16联合起来，共同监测疾病的进展情况，帮助鉴别潜在的高级别的癌前期病变或子宫颈癌。

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