高效液相色谱法测定珍菊降压片中盐酸可乐定的含量

蔡绍东

广东省人民医院药学部，广东广州 510080

珍菊降压片收载于 《中华人民共和国卫生部药品标准》第20册，标准号为WS3-B-3925-98，为中西药复方制剂，主要用于治疗高血压，其主要成分为野菊花膏粉、珍珠层粉、盐酸可乐定、氢氯噻嗪和芦丁[1]。为有效控制药品的质量保证临床疗效，笔者应用高效液相色谱法测定该制剂中盐酸可乐定的含量，现报道如下：

1 仪器与试药

岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪，大连中北色谱工作站；AT-201 电子分析天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒），岛津UV-2550紫外-可见分光光度计，超声波清洗器（SB-3200，宁波新芝科器研究所），LDZ4-0.8自动平衡微型离心机（北京医用离心机厂）。盐酸可乐定对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：100071-199905，规格：100 mg，含量 100%）；珍菊降压片样品 （广东清平制药有限公司生产，国药准字Z44023806；批号：20080601、20080602、20080603），规格：0.25g/片，盐酸可乐定的标示量为每片30 μg。甲醇为色谱纯，辛烷磺酸钠、磷酸、氢氧化钠等为分析纯，水为重蒸超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择迪马液相色谱柱Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.22%辛烷磺酸钠-甲醇-磷酸(560∶440∶1，以 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH至 3.0)，检测波长为 220 nm，流速为 1.0 ml/min，进样量为20 μl，柱温为室温。理论塔板数按盐酸可乐定峰值计算≥4 000。

2.2 对照品、供试品溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 取经过干燥至恒重的盐酸可乐定对照品10 mg，置于100 ml容量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，准确吸取4 ml溶液移至100 ml容量瓶，加流动相溶解稀释至刻度，制成每1 ml含4 μg的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取样品20片，研磨至极细，置电子分析天平精密称定，称取粉末0.25 g（约相当于1片珍菊降压片，含盐酸可乐定30 μg），放置到具塞锥形瓶中，精密吸取枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH=4.0）40 ml加入锥形瓶中，称定重量。经超声提取40 min，冷却后，加入枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH=4.0）补足减少的量；摇匀后置于LDZ4-0.8自动平衡微型离心机，以3 000 r/min离心10 min，精密量取上清液20 ml，精密加碳酸钠试液10 ml，混匀再离心，精密量取上清液20 ml，至分液漏斗中，用二氯甲烷振摇，提取5次，每次25 ml，合并二氯甲烷提取液，放至温水浴中低温挥干；残渣加入流动相充分溶解并定容至5 ml，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过。

2.2.3 阴性对照溶液 按珍菊降压片处方取不含盐酸可乐定的其他原辅料，并按药典工艺制得空白样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 测定方法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算。

2.4 系统适用性试验

在上述色谱条件下，盐酸可乐定的保留时间约为10 min，峰形良好，且阴性对照品实验无干扰，其色谱峰与相邻峰分离度符合规定，理论板数不小于4 000。

2.5 线性关系考察

精密吸取盐酸可乐定对照品适量，加流动相制成每1 ml中含盐酸可乐定对照品 1、2、4、6、8、10 μg的溶液。 取上述各溶液20 μl注入液相色谱仪中，记录色谱图，测定其峰面积。以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标进行线性回归，结果得出：回归方程为 A=1.361 8C-0.137 9（r=0.999 9），可见盐酸可乐定在1.0～10.0 μg/ml范围内,盐酸可乐定峰面积值与浓度呈现良好的线性关系。

2.6 精密度试验

取盐酸可乐定对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，测定峰面积的RSD为0.35%（n=6），表明本法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取盐酸可乐定供试品溶液，按以上色谱条件，分别在1、2、4、8、12、24 h 进样 1 次，共测试 6 次，测定峰面积，RSD 为1.28%，结果显示样品至少在24 h内稳定。

2.8 重复性试验

取同一批号样品（20080601）6份，分别精密称定，按本文方法制备供试品溶液，测定峰面积并计算盐酸可乐定含量（μg/g），结果显示样品盐酸可乐定的标示百分含量分别为96.0%、99.5%、100.3%、97.2%、95.0%、100.7%，平均标示百分含量为98.11%，RSD为1.28%。

2.9 回收率试验

采用加样回收率测定方法。精密称定已知含量样品（20080601）0.25 g，其盐酸可乐定的标示百分含量平均为98.11%，精密加入盐酸可乐定对照品适量，按正文方法处理后测定峰面积并计算含量，结果显示盐酸可乐定平均回收率为99.4%，RSD为0.93%。见表1。

表1 盐酸可乐定加样回收率试验结果

2.10 盐酸可乐定含量测定

按照供试品处理方法对3批样品 （批号：20080601、20080602、20080603）进行处理，注入液相色谱仪，测定结果分别为 29.4 μg/片、29.8 μg/片、30.3 μg/片。

3 讨论

珍菊降压片作为中西药复方制剂，其成分复杂，其中盐酸可乐定含量又非常微小。为保证测定含量的准确精密，排除干扰成份，笔者选择用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，参考《中国药典》（2005年版）二部收载的盐酸可乐定片[2]的流动相和文献[3]，经试验筛选，确定以0.22%辛烷磺酸钠-甲醇-磷酸 （560∶440∶1， 用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至3.0）为流动相。流动相中加入辛烷磺酸钠为离子对试剂，可增加盐酸可乐定的容量因子，显著提高分离效果。

试验中为减少溶剂和流动相的干扰，确保实验结果的准确性，参考国内相关研究结果[4]：盐酸可乐定在220 nm处有一强吸收峰，在270 nm和279 nm处各有一个弱吸收峰。根据盐酸可乐定原料在甲醇中的紫外吸收图谱，其最大吸收在205 nm左右[5]，而氢氯噻嗪和芦丁在270 nm处都有较强吸收峰。为了避免测定时珍菊降压片中含有的氢氯噻嗪和芦丁等组份的干扰，笔者选择220 nm作为检测波长。

本实验结果表明以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，0.22%辛烷磺酸钠-甲醇-磷酸（560∶440∶1）为流动相，检测波长为220 nm，采用高效液相色谱法测定珍菊降压片中盐酸可乐定含量精密度高，准确性良好，可有效控制药品的质量，促进临床合理用药。

[1]国家药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂(第20册)[M].北京：人民卫生出版社,1998：232.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京：化学工业出版社,2005：471-472.

[3]张新学,刘圣梅,李亚芳.HPLC法测定珍菊降压片中盐酸可乐定的含量[J].齐鲁药事,2008,27(10)：662-663．

[4]黄东慧.反相高效液相色谱法测定珍菊降压片中盐酸可乐定的含量[J].临床和实验医学杂志,2009,8(4)：68-69.

[5]杨继斌,汤晓枢.HPLC法测定珍菊降压片中盐酸可乐定的含量[J].药物分析杂志,2006,26(12)：1854-1856.