复合菌固态发酵棉籽粕工艺的初步研究

刘建成 马贵军 蒋粒薪

复合菌固态发酵棉籽粕工艺的初步研究

刘建成 马贵军 蒋粒薪

文章以枯草芽孢杆菌属、酵母菌属和乳酸菌属的6株菌为出发菌株，通过单因素试验和正交试验，确定了6株菌复合培养的最佳培养基配方为：糖蜜40 g/l、蛋白胨10 g/l、葡萄糖1 g/l、磷酸氢二钾0.5 g/l；并对复合菌固态发酵棉籽粕工艺条件进行了研究，确定了复合菌固态发酵棉籽粕的最适工艺条件为：料水比1：0.8，接种量为3%，发酵温度为30℃，pH值自然，发酵时间为48 h。在以上条件下，棉籽粕经过复合菌固态发酵后，物料的pH值降低到4.5以下，有益菌总数达到6.2×108cfu/g，粗蛋白含量提高了1.76%，游离棉酚含量从618.52 mg/kg降低到274.16 mg/kg，降低了55.7%。

棉籽粕；复合菌；固态发酵；游离棉酚；脱酚率

棉籽粕（cottonseed meal,CSM）是棉籽经脱壳、加热、压扁成薄片用溶剂浸出油后，所剩余的副产品。棉籽粕中含粗蛋白40%以上，还含有丰富的赖氨酸、蛋氨酸，是畜禽饲料中非常有价值的一种原料。我国是一个产棉大国，每年有1 100万吨以上的棉籽，年可产棉籽饼粕600万吨以上，资源量全球第一[1]。棉籽饼粕是一种极具开发潜力的植物蛋白饲料资源。但是，棉籽饼粕用作饲料存在三方面的不利因素：①棉籽饼粕含有有毒物质游离棉酚，会对动物生产、发育和繁殖等方面产生不良影响[2-3]；②棉籽饼粕中含有纤维素、半纤维素等难以消化的物质和植酸等抗营养因子[4]；③蛋白质品质差，蛋氨酸等必需氨基酸含量低，赖氨酸易于与棉酚结合形成复合体，难以被动物利用。上述因素限制了棉籽饼粕安全而有效的用作动物蛋白饲料，部分地区甚至将其贬作肥料，造成饲料资源的严重浪费。因此，开展有效利用棉籽饼粕的研究，对促进畜牧业发展具有重要意义[5-9]。

棉籽粕发酵的研究最早是在我国上世纪70年代，在国外除了前苏联有少量报道外，基本上未见相关报道。微生物发酵法可以说是我国研究人员在棉籽粕脱毒研究领域采用的较独特的一种技术手段[7-8]。微生物固态发酵的方法是通过微生物作用把棉籽粕中的棉酚有效去除，并通过微生物活动改变棉籽粕营养成分[9-10]，提高粗蛋白含量，尤其改善了粗蛋白的品质及可利用性，并对棉籽粕蛋白质进行一定程度的降解，尤其是发酵降解产生的小分子多肽有利于畜禽的消化吸收，提高其利用率。微生物发酵能在脱毒的同时生成菌体蛋白和维生素[8]。微生物发酵产生的益生菌、乳酸、未知生长因子等物质，可以促进肠道中乳酸菌、双歧杆菌等有益菌的增殖，维持肠道内菌群平衡，提高免疫力，同时改善适口性、提高采食量[9-10]。

本文在总结以往棉籽粕单一菌种发酵研究的基础上[11-16]，对棉籽粕复合菌固态发酵的最适条件进行筛选，以求在降低棉籽粕中游离棉酚含量的同时，能改善棉籽粕的营养价值和饲用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

枯草芽孢杆菌属、酵母菌属和乳酸菌属共六株菌，全部购自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）。

1.1.2 供试培养基

乳酸菌属（g/l）：蛋白胨 10、牛肉膏 10、酵母浸膏5、葡萄糖 5、磷酸氢二钾 2、乙酸钠 5、柠檬酸铵 2、硫酸镁 0.2、硫酸锰 0.05、吐温80 1、琼脂 20，pH值6.8，121℃高压灭菌20 min。

枯草芽孢杆菌属（g/l）：氯化钠 0.5、牛肉膏 1、蛋白胨1、琼脂15，pH值7.2，121℃高压灭菌20 min。

酵母菌属（g/l）：麦芽浸粉 1、葡萄糖 1、琼脂 20，在121℃下高压灭菌20 min。

初始复合菌培养基（g/l）：糖蜜 10、蛋白胨 10、葡萄糖 5、磷酸氢二钾 2、硫酸镁 0.2，pH 值 7.0～7.2，121 ℃高压灭菌25 min。

最佳复合菌培养基（g/l）：糖蜜 40，蛋白胨 10，葡萄糖1、磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.2，pH值7.0～7.2，121℃高压灭菌25 min。

1.1.3 固态发酵底物（g/kg）：棉籽粕 900，麸皮 95、天康原酶 5、糖蜜 10，121℃高压灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 复合菌的培养方法

用1 ml无菌水将各菌菌体从斜面上洗下，接种于装有50 ml种子培养基的200 ml大试管中，在智能生化培养箱中30℃静止培养48 h。

1.2.2 复合菌培养基的优化方法

试验因子包括糖蜜浓度、蛋白胨浓度等影响复合菌生长的因素。优化方法采用单次单因素法，然后进行正交试验，得出最优结果。

1.2.3 棉籽粕固态发酵条件的优化方法

将最佳条件下培养好的种子液以3%的接种量与水混匀，在与固体发酵培养基充分混匀后每袋200 g装入采样袋、密封，于培养箱中静止发酵。优化方法采用单次单因素法，根据发酵后物料感官指标、pH值、细菌总数和粗蛋白含量确定最佳发酵条件。

1.2.4 棉籽粕中各指标测定方法

pH值的测定：雷磁pH计；

细菌总数的测定：饲用细菌总数的测定参考GB13093—91 的方法进行[17]；

粗蛋白含量的测定：采用凯氏定氮法（GB6432—94）[17]；

棉酚含量的测定：采用苯胺法（GB13086—91）[17]。

2 结果与分析

2.1 复合菌培养基的优化

2.1.1 糖蜜浓度对复合菌生长的影响（见图1）

图1 糖蜜不同浓度对复合菌体生长的影响

糖蜜是一种廉价的碳源，可为菌体的生长提供能源和合成菌体所必需的碳成分。为了研究不同糖蜜浓度对复合菌生长的影响，将糖蜜浓度设置成10、20、30、40、50 g/l，通过测定不同浓度条件下复合菌生长量（吸光度A600），以确定复合菌生长所需的最佳糖蜜浓度。

从图1中可以看出，当糖蜜浓度小于40 g/l时，随着糖蜜浓度的增大，A600值逐渐增大而且增幅明显，而当糖蜜浓度从40 g/l增大到50 g/l时，其A600值增加较小。所以确定复合菌生长的最佳糖蜜浓度为40 g/l。

2.1.2 蛋白胨浓度对复合菌生长的影响

蛋白胨是一种很容易被微生物利用的良好氮源，因为它含有丰富的氨基酸、还原糖、磷等微量元素和生长素。为了研究蛋白胨浓度对复合菌生长的影响，将蛋白胨浓度设置成 5、10、15、20、25 g/l，通过测定不同浓度条件下复合菌生长量（吸光度A600），以确定复合菌生长所需的最佳蛋白胨浓度，结果见图2。

图2 蛋白胨不同浓度对复合菌生长的影响

从图2中可以看出随着蛋白胨浓度的增加菌体浓度也是逐渐增大的，但大于10 g/l后菌体浓度增幅不显著。考虑到蛋白胨价格昂贵和菌体种子液浓度的需要选择10 g/l的蛋白胨为最佳浓度。

2.1.3 复合菌最佳生长培养基的确定

为了考察复合菌培养基中4大影响因素：糖蜜、蛋白胨、葡萄糖和磷酸氢二钾对菌体生长影响的相互作用，以单因素试验的结果为参考，设计L9（34）正交试验，因素水平如表1所示，正交试验结果见表2，以复合菌生长量（A600）为指标绘制曲线图见图3。

表1 复合菌培养基优化的正交试验因素水平

正交实验结果表明，各个因素的最佳浓度为糖蜜50 g/l，蛋白胨 15 g/l，葡萄糖 1 g/l，磷酸氢二钾 0.5 g/l。其中，菌体浓度随着糖蜜浓度的增加而增大；蛋白胨浓度从5 g/l增加到10 g/l时，菌体浓度增加明显，而当蛋白胨浓度从10 g/l增加到15 g/l时，菌体浓度增加不明显。考虑到新疆糖蜜资源匮乏，糖蜜、蛋白胨原料成本较高，为了能降低生产成本，实现工业化大生产，综合单因素试验结果，确定培养基中影响菌体生长的四个因素的最佳组合为：糖蜜40 g/l，蛋白胨10 g/l，葡萄糖1 g/l，磷酸氢二钾0.5 g/l。

表2 复合菌培养基优化的正交试验及结果

图3 复合菌培养基优化的正交试验结果

2.2 复合菌固态发酵条件的研究

为了使复合菌在发酵底物中能充分生长，还必须满足复合菌对环境条件的要求，使其处于生长的优化环境中。本试验就料水比、接种量、发酵温度以及发酵时间等影响棉籽粕复合菌固态发酵的环境条件进行了研究。

2.2.1 料水比对固态发酵棉籽粕的影响

水分对微生物的生长繁殖和产物合成极为重要。所以在固体发酵过程中，培养基水分含量十分重要，发酵物料中的水分既是微生物进行物质交换的媒介，又是其生存的环境条件。水分含量过低，满足不了微生物生长的需要，有机物难以分解；水分含量过高，则易堵塞料堆中的空隙，使氧气含量减少，影响微生物的发酵作用。本试验对固态发酵不同料水比1：0.4、1：0.6、1：0.8、1：1和 1：1.2进行了研究，结果如图 4。

由于发酵所用的复合菌中大多数为细菌，而细菌对水分的要求较高，所以从图4中可以看出，随着料水比的增加，菌体量成逐渐增大趋势，并且pH值随着菌体量的增大而逐渐减小。但在大工业生产中，过高的水分含量容易引进杂菌污染，并显著增加烘干成本。因此，确定物料发酵的最佳料水比为1：0.8。

图4 不同料水比对棉籽粕固态发酵的影响

2.2.2 接种量对固态发酵棉籽粕的影响

菌种接种量的大小对发酵的影响也比较大，其直接影响发酵时间。接种量太小，菌体增长缓慢，培养时间长，使发酵周期延长，同时会降低菌种活力，不利于发酵。但接种量过大，会显著增加成本。为了考察复合菌接种量对发酵棉籽粕的影响，在其它发酵条件相同的情况下，进行了不同接种量1%、3%、5%、7%和10%条件下的发酵试验，结果如图5所示。

图5 不同接菌量对棉籽粕固态发酵的影响

从图5中可以看出，随着接菌量的增大，发酵后物料中细菌总数逐渐增大，但pH值变化不显著，说明接菌量在所选范围内都能达到棉籽粕发酵的要求。因此，确定其最佳接菌量为3%。

2.2.3 温度对固态发酵棉籽粕的影响

适宜的培养温度对微生物的生长也是必不可少的。对不同温度20、25、30、35和40℃下复合菌发酵棉籽粕的品质进行了比较研究，结果如图6所示。

由图6可以看出，当温度低于20℃后，不利于复合菌的生长。当温度在20～40℃变化时，随着发酵温度的增加，菌体量逐渐增大。当温度从20℃增加到30℃的过程中,发酵物料的菌体量从34×106cfu/g增加到207×106cfu/g,增大了约6倍。pH值从5.2降到4.18，降低了1.02。温度从30℃增大到40℃过程中，菌体量增加不明显，pH值从4.18降到4.02，变化也不明显。考虑到在大生产中大宗物料不易加热，为了尽量降低生产成本，实现大规模工业化生产，选择复合菌的最佳发酵温度为30℃。

图6 不同温度对棉籽粕固态发酵的影响

2.2.4 发酵时间对固态发酵棉籽粕的影响

棉籽粕营养性能的改善依赖的是微生物的作用，微生物的生长与发酵时间有着直接的关系。为此我们研究了不同发酵时间对棉粕固态发酵结果的影响，结果如图7。

图7 不同发酵时间对棉籽粕固态发酵的影响

从图7中可以看出，0～24 h，菌体量迅速增长，pH值从6.05快速降为4.40。24～48 h，菌体量继续增加，pH值降至4.14。48～96 h，菌体量开始下降，在此期间pH值变化不大。说明经过48 h发酵之后，菌体量就可达到最大值，同时由于复合菌中乳酸菌的大量生长，产生有机酸及一些芳香性物质，可使得物料有明显的酸香味，提高了物质的感官品质。

2.3 复合菌固态发酵前后比较结果（见表3）

表3 最适条件下复合菌固态发酵前后比较结果

在以上所有最适条件下，研究了复合菌固态发酵对棉籽粕营养价值的影响，发酵前与发酵后的对比结果。

3 讨论

3.1 复合菌种的培养

本研究采用了6种不同菌种对棉籽粕进行了混合菌固态发酵，混合菌种是以各单一菌种为基础，按1：1接入种子培养基中，经过增殖培养而得到种子菌液。在种子菌液培养过程中，由于各个菌生长性能不同，因此在增殖培养后的种子菌液中各个菌的比例可能改变，并影响固态发酵，所以有必要进一步研究以确定棉籽粕固态发酵时接入的各个菌实际含量，从而更进一步提高发酵棉籽粕的营养价值。

3.2 发酵棉籽粕中蛋白质的变化

在固态发酵过程中，我们测定了发酵前后的蛋白质变化，发现粗蛋白变化不显著。而浙江大学顾赛红等用黑曲霉PES对棉籽粕进行固体发酵，使棉籽粕的粗蛋白提高了10.92%[12]。石河子大学张文举等利用由乳酸菌与酵母菌等主要有益菌组成的复合菌发酵棉籽壳，发酵后棉酚含量降低，脱毒率达到75.4%，粗蛋白（CP）提高2.29%[13]。如何能通过微生物的发酵作用进一步提高棉籽饼粕的粗蛋白含量有待于进一步研究。复合菌的发酵作用能否将棉籽粕的大分子蛋白质降解为动物更易消化吸收的小分肽，有待于进一步测定。

3.3 发酵工艺

为了适应工业化大生产，本研究采用了原料不灭菌而直接接入复合菌进行固态发酵的工艺，简化了生产步骤并省去了大量的能源成本。所需发酵温度范围广，发酵条件要求不高，而发酵结果非常好，有利于实现工业化大生产。

4 结论

通过单因素试验和正交试验，确定了复合菌生长的最适培养基配方为：糖蜜40 g/l、蛋白胨10 g/l、葡萄糖1 g/l、磷酸氢二钾0.5 g/l。对棉籽粕复合菌固态发酵工艺条件进行了研究，确定了复合菌固态发酵棉籽粕的最适工艺条件为：料水比1：0.8，接种量为3%，发酵温度为30℃，pH值为发酵的起始值，发酵时间为48 h。

在最适条件下通过复合菌固态发酵可使棉籽粕pH值从6.13降至4.25，有益菌总数增加到几千万个，棉酚含量降至274.16 mg/kg，降低了55.67%，达到国家标准规定以下。粗蛋白含量提高1.76%，并且使棉籽粕产生了另人愉悦的酸香气味，提高了诱食性。为工业化生产发酵棉粕具有一定的指导意义。

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The preliminary study of composite strain solid-state fermentation cottonseed meal

Liu Jiancheng,Ma Guijun,Jiang Lixin

In this paper,bacillus subtilis,yeasts and lactic acid bacteria is a strain of 6 as the starting strain,through a single test and single-factor orthogonal experiment,six strains identified the best coculture medium as follows:molasses 40 g/l,peptone 10 g/l,glucose 1 g/l,K2HPO40.5 g/l;and cottonseed meal composite solid-state fermentation conditions for bacteria to carry out a study to determine the composite solid-state fermentation bacteria cottonseed meal the optimum conditions were as follows:water ratio 1：0.8 material,inoculum was 3%,fermentation temperature is 30℃,pH value of the start value for the fermentation,the fermentation time of 48 h.In these conditions,cottonseed meal bacteria through complex solid-state fermentation,the fermentation the pH values were reduced to below 4.5,the total number of bacteria 6.2×108cfu/g,the crude protein content increased 1.76%,free gossypol content reducing 618.52 mg/kg to 274.16 mg/kg,decreased 55.7%.

cottonseed meal；composite strain；solid-state fermentation；free gossypol；phenol removal rate

S816.34

A

1001-991X（2011）07-0032-05

刘建成，新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生物添加剂分公司，工程师，830011，新疆乌鲁木齐市安宁渠路2号。

马贵军、蒋粒薪，单位及通讯地址同第一作者。

2011-01-11

（编辑：刘敏跃，lm-y@tom.com）