原子力显微镜扫描成像DNA分子

冉诗勇，王艳伟，杨光参

（温州大学 物理与电子信息工程学院，浙江 温州325035）

1 引 言

1982年，IBM瑞士苏黎士实验室的宾尼（Gerd Binning）和罗雷尔（Heinrich Rohrer）研制出世界上第一台扫描隧道显微镜（STM）［1］，STM使人类能在原子或分子的尺度上观察甚至操纵原子，他们也因此获得了1986年的诺贝尔物理学奖．STM要求扫描样品是导电材料，应用上受到了限制．为了拓宽应用范围，1986年宾尼在STM的基础上发明了原子力显微镜（AFM）［2］．AFM对样品无特别要求，一经发明就在各领域研究特别是在生物大分子（如DNA、蛋白质）扫描成像研究领域得到了广泛的应用．

传统的近代物理实验教学一般引入STM扫描实验［3－5］，所用样品一般是成品，学生亲自动手制备样品可行性较小．与之相比，AFM样品制备的简便性使样品制备这一流程引入实验教学环节成为可能．已往的科学研究中已积累了不少的生物大分子 AFM 成像技术［6－11］．我们在近年来的近代物理实验教学中，将生物物理研究实验技术如单分子实验技术［12］、AFM等融入近代物理实验教学和本科生毕业设计，取得了一定的教学效果．本文将先介绍AFM的基本原理，然后介绍AFM用于DNA分子扫描成像的实验，着重于样品制备技术和实验步骤．该实验既能让学生掌握AFM的原理，又能让他们学习一些基本的AFM扫描用生物样品制备方法．

2 实验原理

2．1 装置原理

AFM利用微悬臂上的探针尖端充当力传感器．图1（a）为常用探针的光学显微镜成像，（b）为侧面图．针尖与样品之间的作用力会使悬臂偏转．因此当激光照射在微悬臂的末端时，其反射光的位置也会因为悬臂偏转而改变，造成偏移量的产生．系统利用四象限探测器将偏移量记录下并转换成电信号．以供控制器作信号处理（图2）．AFM检测到悬臂的偏转后，可以工作在恒高或恒力模式下得到形貌图像数据．在恒高模式下，扫描器的高度是固定的，根据悬臂的形变信号转换成形貌图像，该模式一般用于原子级别平整度样品成像．在恒力模式下，悬臂偏转信号输入到反馈电路，反馈系统根据信号相应地改变由压电陶瓷管制备的扫描器的Z轴驱动电压，使之上下运动，以维持针尖和样品原子的相互作用力恒定．在此过程中，Z轴驱动电压信号被转换成形貌图像数据，该模式一般优先使用．

图1 不同模式探针的光学显微镜成像以及探针的侧面图

图2 原子力显微镜基本结构示意图

2．2 操作模式

原子力显微镜与样品间的相互作用以范德华力为主，其作用势能一般用Lennard－Jones势能函数表示：，式中r是两原子的核间距，σ是势能为0时原子核间距，ε是势阱深度，是势能曲线上最低点势能的绝对值．当悬臂尖端的原子与样品靠近，开始时吸引力起主导作用，随着距离的减小，二者之间的吸引力与排斥力将趋于平衡，当两原子进一步靠近时，范德华力以斥力为主（图3）．根据使用的力的性质，可以使仪器具有不同的操作模式．接触模式利用的是针尖与样品之间的排斥性质范德华力，用于研究柔软的生物样品时由于接触可能使之受到破坏并污染探针产生假象，因此并不是用于生物样品扫描的理想模式．非接触模式利用的是针尖与样品之间的吸引性质范德华力，由于针尖与样品的间距较大，样品的扫描分辨率较低．轻敲模式是介于接触模式和非接触模式之间的一种扫描模式．该模式下针尖与样品之间周期性地间歇接触，好比针尖不断地敲击样品．与非接触模式的工作原理类似，是使悬臂振动，其振幅比非接触模式更大，因而能间歇地与样品接触．与非接触模式相比，其分辨率更高；与接触模式相比，其克服了因针尖划过样品而受到的摩擦力、黏附力、静电力等的影响，并有效地避免了样品损坏，对于研究比较软的样品如生物大分子而言十分有利．

图3 Lennard－Jones势能函数示意图

3 仪器装置

所用原子力显微镜型号为SPM－9600（岛津公司），轻敲模式探针购买自Nanoworld，悬臂弹性系数42 N／m，共振频率320 k Hz．样品在室温下以轻敲模式在空气中成像．所有图像采集的扫描频率为2～3 Hz，尺寸为512像素×512像素．所有图片都经过平滑去噪处理以提高对比度．

4 样品制备

云母本身是层状结构，表面具有原子级别的平整度，用透明胶布可以方便地解理得到干净平整的表面．因此，本实验将云母切割成合适大小，用双面胶粘在直径约1 cm，厚约1 mm的圆形铁片上，利用其作为衬底制备样品．实验所用水均为去离子水．λ－DNA （48，502个碱基对）购于NEB公司，3－氨丙基三乙氧基硅烷（3－aminopropylrtiethoxysilane，APTES）、戊二醛和组蛋白均购于Sigma公司．在实验时，采用TE（10 mmol／L Tris－HCl＋1 mmol／L EDTA，p H8．0）缓冲液来稀释λ－DNA．图4所示是基本的样品处理流程图，在该流程基础上可以增加或稍作改变一些操作步骤以适应样品制备需求．由于云母表面带负电，而DNA分子也带负电，单纯地将DNA样品沉积到云母表面会由于静电斥力而不能稳定地沉积在云母表面．因而，一般对云母表面进行了修饰或在DNA溶液中加入带正电的离子．沉积在云母表面的DNA构象一般是溶液中的线团状态在二维表面上的投影，仍然是二维蜷曲的．为方便观察或者统计分析，可以在必要时将DNA拉直成像．下面具体介绍这些样品制备方法．

图4 样品制备基本流程示意图

1）Mg2＋处理DNA方法．首先将TE溶液加入MgCl2使其最终浓度为3．5 mmol／L，然后用该TE＋3．5 mmol／L MgCl2缓冲溶液稀释原始DNA溶液至1 ng／μL．然后解理云母片得到新的1层云母面，用移液器取约10μL稀释DNA溶液滴在表面，沉积3 min，然后用约200μL纯水冲洗，氮气吹干放入干燥器1 h以上待扫描．

2）APTES处理云母表面方法．首先取1%（V／V）的APTES水溶液约30μL滴在新解理的云母表面，放置约15 min，用超纯水冲洗约5 min，氮气吹干，然后放置在120℃烘箱中加热30 min（该步骤的目的是钝化表面），冷却后放于干燥器中待用．然后如图4所示将1 ng／μL的DNA溶液10μL滴在云母表面，沉积3 min，接着用纯水冲洗并氮气吹干放入干燥器．

3）戊二醛修饰云母表面方法．首先将50μL 0．01% （V／V）戊二醛用移液器滴在APTES处理过的云母上，静置5 min，然后用纯水冲洗5 min，氮气吹干．接下来在该修饰云母上沉积DNA的步骤与图4所示基本流程相同．

4）DNA拉直方法．首先将约10μL稀释DNA溶液或DNA－组蛋白复合物溶液滴在APTES处理过的云母片上（由于APTES的疏水作用，小液滴呈现小珠状），样品沉积在云母表面约5 min，用镊子夹着云母片与桌面成45°，氮气从液滴上方与云母成较小角度吹液滴，使其慢慢脱离云母表面．然后用移液器滴约20μL纯水在云母上，用移液器枪嘴稍微接触液滴的边缘，按照第一步中液滴移动的方向慢慢吸走样品，如此重复20次左右，氮气吹干，干燥．

5 实验结果与分析

图5（a）为利用Mg2＋处理方法扫描得到的λ－DNA形貌，可以看到DNA处于自然蜷曲线团状态，分布均匀，图像清晰，效果较好．APTES是一种硅烷化试剂，修饰在云母表面后其末端氨基能够固定DNA片段，因此与Mg2＋处理方法相比具有不易受操作因素而影响沉积DNA构象的优点．图5（b）是在APTES处理的云母基底上利用拉直技术成像的DNA－组蛋白复合物形貌，可以看到DNA的拉直效果很好，并且DNA与组蛋白结合之后成串珠状形貌，与染色质结构类似．由于组蛋白带正电，如果组蛋白浓度过高，其正电荷会完全中和所结合的DNA所带负电荷，甚至复合物本身带上正电，从而与APTES处理的带正电云母基底相排斥，造成复合物不能稳定地沉积，导致扫描成像不能观察到复合物．因此，利用戊二醛处理云母表面方法沉积带正电的生物大分子复合物．图5（c）即为利用该方法得到的高组蛋白浓度下的DNA－组蛋白复合物（组蛋白浓度为60 nmol／L，DNA浓度为1．5 ng／μL）形貌，可以看到复合物仍然能结合在云母上良好成像．该方法的原理是利用戊二醛的蛋白质偶联作用结合上组蛋白分子并将之固定在衬底上，即使经过冲洗和氮气干燥步骤也能得到稳定的沉积物．

扫描成像的效果还受操作因素的影响．具体来说，Mg2＋处理方法中如果Mg2＋浓度过高或者冲洗不充分，过多的Mg2＋会通过离子桥连作用造成DNA分子之间的交联，扫描时得到不理想的网状结构．图5（d）是 Mg2＋浓度为5 mmol／L时由于冲洗不充分，有过多的Mg2＋参与DNA分子之间的交联而造成的网状结构．而如果冲洗步骤中移液器吸取溶液速度过快造成负压过高，可能会将已沉积上的大分子吸入或者改变其沉积形貌，很难观察到沉积的大分子或者非正常的形貌．此外，氮气干燥时如果氮气流速过高，可能造成同样的后果．因此，为提高实验的可重复性，需要控制吸取速度和氮气流速使之适中．一般在云母片边缘以低于3μL／s的速度吸取溶液，干燥时氮气流速控制在刚好能吹走表面液滴的速度．

图5 λ－DNA及DNA－组蛋白复合物图像

6 结束语

本文介绍了利用AFM成像DNA大分子以及DNA－组蛋白质复合物的实验方法．该方法不仅可用于科学研究，还可引入近代物理实验教学．该实验的开设可提高学生的动手操作能力，并对生物学中重要的大分子如DNA分子进行直接观察，拓宽学生们对生物学与物理学结合领域的认识．

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