利用RNA捕获法在全基因组进行egfr启动子片段的富集

杨 锦 邹斌斌 张玉祥 王泽生

(首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系)

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)参与调控细胞代谢、增生、迁移和分化。其过度表达可加速细胞分裂与增生，抑制凋亡，有助于血管形成，并促进癌细胞转移［1］。人类肿瘤包括非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、结肠癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、口腔癌等都可表达或高表达EGFR［2］。肿瘤中的EGFR表达与疾病侵袭性增强、化疗抵抗增加、转移性增强，生存率下降及临床预后差相关［3］。

egfr基因5'调控区包括1个富含GC的启动子，缺少保守序列TATA盒和CAAT盒，有多个位点可以起始转录［4］。egfr启动子在－216G/T存在多态性并与其增加活性相关［5］。深入了解egfr基因在肿瘤内的表达调控将有助于我们对该基因的表达进行干预，并治疗相应肿瘤。进行这类研究需要大规模、多样本的基因组重测序。尽管第二代测序成本已明显降低，但全基因组重测序需要大量的时间和高额的成本，制约其应用于疾病研究。基因组目标区域重测序策略不需对全基因组进行测序，只对基因或其他感兴趣的基因组区域的基因序列重新测定。国际上已发表的研究报告［6－7］均采用商业公司推出的目标序列捕获解决方案。本研究以宫颈癌细胞系HeLa S3 egfr启动子为模型，建立了一套简便易行的RNA捕获靶序列的富集体系，结合Solexa测序方法，为各种复杂人类疾病相关突变的检测奠定良好基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1)细胞株:宫颈癌细胞系HeLa S3(购于北京协和细胞库)。

2)主要试剂:RPMI 1640培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Hyclone公司);MboI、Klenow Fragment、Klenow Fragment(3'→5'exo-)、T7 RNA Polymerase、rNTP(美国NEB公司); T4 DNA连接酶、Ex Taq(日本Takara公司);Biotin-11-dUTP(立陶宛Fermentas公司);Biotin-16-UTP(美国Ambion公司);Dynabeads M-280 Streptavidin(美国Invitrogen公司);DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒(德国Qiagen公司);引物合成单位(中国上海生工生物工程有限公司);高通量测序单位(北京六合华大基因科技股份有限公司深圳分公司)。

1.2 方法

1)细胞培养:在5%CO2，37℃的培养箱中，用含有10%FBS的RPMI 1640培养基对HeLa S3细胞进行培养。

2)DNA文库的制备:①细胞基因组的提取:8 000 g离心1 min，收集细胞，加入终浓度为0.5 μg/μL蛋白酶K，55℃消化过夜。消化16 h后再加入终浓度为0.2 μg/μL的RNase A，在37℃水浴30 min消化RNA，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，加入50 μL无菌水溶解。②MboⅠ酶切基因组:取基因组2 μg，50 μL体系中加入5 μL 10×NE Buffer2，加入5 U的限制性内切酶MboⅠ，在37℃下水浴，消化过夜。65℃水浴20 min灭活限制性内切酶活性。③DNA片段两端加接头:加入2 μL 10× NE Buffer2，加入终浓度为0.1 mmol/L的dNTP，加入Klenow Fragment(3'→5'exo-)15 U，在37℃水浴30 min。将体系扩大到100 μL，加入终浓度为1×T4 DNA连接酶缓冲液，加入终浓度为0.8 μmol/L的3'端‘T’突出的Pair-end adapter 1和Pair-end adapter 2(表1)，加入50 U的T4 DNA连接酶，16℃水浴过夜。④DNA片段的纯化、回收:酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，加入15 μL无菌水溶解。所得DNA用1.5%琼脂糖胶电泳，QIAGEN试剂盒胶回收400～1 000 bp DNA，加入100 μL无菌水溶解作为杂交模板。

3)生物素标记egfr启动子片段的RNA制备和RNA/DNA杂交捕获:①egfr启动子片段两端加T7，SP6 adapter:以基因组DNA为模板，用egfr promotor primer (表1)扩增egfr启动子片段272 bp，液体回收后加上T7，SP6 adapter(表1)，用T7，SP6引物PCR扩增egfr启动子片段，即得到带有T7启动子的egfr启动子片段。②egfr启动子片段转录为RNA:液体回收PCR产物，30 μL反应体系中含有4 mmol/L rNTP，1×T7 RNA Polymerase buffer，75 U T7 RNA Polymerase，0.3 mmol/L biotin-16-UTP，37℃水浴3 h。③egfr启动子RNA/3C模板杂交: 200 μL反应体系中含有5×SSC buffer(0.75 mol/L NaCl，0.075 mol/L柠檬酸钠)，加入DNA模板100 μL，95℃加热2 min，冰上1 min，加入RNA 30 μL，65℃杂交24 h。④egfr启动子片段富集:取链亲和素包被的Dynal磁珠10 μL，用100 μL 2×B＆W缓冲液悬浮磁珠，加入100 μL的生物素化RNA/DNA，轻轻旋转，室温下放置过夜。用200 μL 1×TWB缓冲液洗3次，70℃加热30 min，取上清，即得到生物素化的RNA/DNA(图1)。

图1 RNA捕获法技术流程图Fig.1 Schematic representation of RNA capture method

表1 PCR引物及接头序列Tab.1 Sequence of pair-end adapters and PCR primers

4)样本扩增和高通量测序:50 μL反应体系中含有0.4 mmol/L PE引物(表1)，0.2 mmol/L dNTPs，1.25 U Ex Taq DNA聚合酶，5 μL DNA模板。98℃变性30 s后，再依下列条件进行PCR:98℃变性10 s，62℃退火30 s，72℃延伸60 s，15个循环后，72℃延伸5 min。产物纯化定量。RNA捕获的样本扩增15个循环后，进行Solexa高通量测序。

2 结果

2.1 MboⅠ酶切基因组DNA

结果显示，MboⅠ酶消化的基因组DNA产生从大到小均一的酶切片段，与对照基因组相比，消化比较完全(图2)。

图2 MboⅠ酶切基因组DNA琼脂糖凝胶电泳Fig.2 MboⅠdigestion efficiency by gelelectrophoresis assay M：100 bp DNA ladder;1：HeLa S3 genome DNA treated by MboⅠ;2：HeLa S3 genome DNA untreated by MboⅠ with same quantity as control.

2.2 egfr启动子片段转录为RNA

用T7 RNA Polymerase转录egfr启动子272 bp，37℃水浴3 h后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测转录产物，可见egfr启动子RNA呈弥散分布(图3)。

图3 T7 RNA Polymerase转录egfr启动子片段琼脂糖凝胶电泳Fig.3 Agarose gelelectrophoresis of egfr promotor DNA transcription by T7 RNA PolymeraseM：100 bp DNA ladder;1：egfr gene promotor DNA;2：egfr promotor RNA after transcription.

2.3 egfr启动子片段富集的验证

分别取富集前和富集扩增后的DNA模板12 ng作模板，用egfr promotor primer(表1)扩增，产物液体回收纯化。琼脂糖胶电泳结果显示egfr启动子片段经过RNA杂交捕获后有富集(图4)。

2.4 Solexa高通量测序结果评价：测序结果Reads比对不同的基因分析

图4 egfr启动子片段PCR琼脂糖凝胶电泳Fig.4 Agarose gelelectrophoresis of egfr gene promotor DNA PCRM：100 bp DNA ladder;1：egfr gene promotor PCR using template before enrichment;2：egfr gene promotor PCR using template after enrichment.

Solexa高通量测序结果的数据作为实验组，用黑色表示，从实验组中随机取总条数为106reads，比对到egfr启动子片段reads条数为1 889条，而比对到随机挑选的notch 1、pdgf-B、src基因reads条数为2、3、3条。从人类全基因组随机取总条数106的等长reads作为对照组，用白色表示，比对到notch 1、pdgf-B、src、egfr基因reads条数分别为3，2，3，2条。横坐标轴表示各基因名称，纵坐标轴表示比对到各基因片段reads条数取log值。分析显示，RNA捕获法在本实验中进行全基因组egfr启动子片段富集了630倍(图5)。

图5 Reads比对不同的基因分析Fig.5 Analysis of Reads mapping different genes

3 讨论

基因组测序分析能够为基因DNA序列提供最真实可靠的信息，它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性［8］。随着人类基因组计划的完成和测序技术的不断发展，可以大规模地筛选突变基因，并对基因多态性进行检测，有助于发现罕见的基因突变和肿瘤组织中基因组水平的变异［9］。但是在全基因组水平进行测序目前的费用还比较昂贵，一般课题组难以承受，基因诊断和治疗技术的普及受到DNA富集方法的限制。本课题组采用RNA捕获法将egfr启动子片段转录为RNA，与基因组进行杂交富集，并洗去基因组的其他部分，用PCR扩增建立测序文库，进行高通量测序并利用生物信息学技术进行分析，证明RNA捕获法对egfr启动子有明显的富集作用。传统的靶向重测序技术如PCR技术，费用过高或者通量过低［6］，该技术与之相比，具有一定的优越性，它不存在偏向性，可以高效富集DNA，针对性强，简便易行，且降低了测序成本。Nimbl Gen公司［10］推出的基于芯片杂交的全外显子捕获芯片，内含210万个寡核苷酸探针，可以捕获人类大部分外显子，通过测序识别在外显子中的基因变异。Agilent公司［11］推出了基于芯片杂交和液相杂交的全基因组外显子捕获产品，捕获探针的长度是120 bp，每管溶液中包含55 000个生物素化的RNA探针，Agilent公司还发展了在线eArray设计平台，可以根据客户需要自行设计探针。但是对于一般的研究单位而言，费用仍较高，需要提前订购，在技术也并非简便易行。

本技术利用RNA捕获法，不仅可以对感兴趣的靶区段自行设计，还可以自行制备生物素化的RNA探针，降低了成本。除了对外显子或编码序列设计探针外，还可以对感兴趣的非编码序列自行设计和制备RNA探针。本实验RNA探针的长度达272 bp，而且在序列捕获时采用较高温度，提高了捕获反应的特异性。本技术结合高通量技术深度测序所富集区域，而非全基因组序列，从而提高效率，降低成本。它可以用于大规模、多样本的与疾病相关的基因和基因组水平异常的研究，包括单核苷酸多态性，基因组结构变异，群体多态性，可变剪切等。该技术为研究人员提供了一种低成本、高效率、灵活的目标测序方法，可以适用于多种不同的应用领域，它的研究与发展将会在重大疾病研究中发挥重要作用。

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