HIV Nef的结构特点及生物学作用

张宏伟 吴 昊

(首都医科大学附属北京佑安医院感染科)

负调控因子(negative factor，Nef)作为人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)附属蛋白之一，其基因在灵长类慢病毒，即HIV-1，HIV-2和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)中高度保守，表达于病毒生活周期的早期。早期研究［1－3］表明，该基因的蛋白产物对病毒复制具有抑制作用，因而得名为“负性因子”或Nef。但随着研究的深入人们发现，Nef能够增强病毒的复制能力和感染性，促进艾滋病病情的进展［4－5］。本文对于Nef的结构特点及生物学作用进行综述如下。

1 Nef蛋白的结构特点

HIV Nef蛋白是相对分子质量为25 000～34 000的豆蔻酰化蛋白，存在于细胞质和细胞膜上［6］。目前尚未发现Nef蛋白具有酶活性。大量研究［7－9］显示，Nef具有一些保守模体，这些模体可与细胞因子发生相互作用。因而，Nef具有衔接蛋白的功能，通过蛋白-蛋白之间的多重相互作用调节细胞的信号转导。

Nef的柔韧性相对较大，具有较大的溶剂暴露面和一些无序区。正是由于这些特点，很难获得Nef蛋白全长序列的精确三维结构。然而，采用X线晶体学以及磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)的方法，Nef的球形核心结构域(第54～205位氨基酸残基)已经被成功解构［10－11］，此外，运用NMR光谱分析技术，Geyer M等［7］又成功解析Nef蛋白氨基端锚定结构域的结构，除氨基端豆蔻酰化基团外，部分空间排列有序。基于这些构象解析，Geyer M等［12］设计出一种预测Nef蛋白全长序列的构象的模型。在此模型中，Nef表面由许多线性排列的蛋白-蛋白相互作用结构域组成，因此，具有较大的弹性。Nef的柔性使该蛋白能够在多种构象间进行转换，其构象依其所结合的对象而定。

2 Nef的生物活性

2.1 Nef对主要组织相容性复合体I(major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ)功能的影响

在1989年，两项研究［13－14］先后报道了在HIV感染的T细胞中MHCⅠ下调的现象。7年后，Schwartz O及其同事［15］发现，HIV-1 Nef是引起这一效应的附属蛋白。突变研究［8］显示，破坏Nef的含有蛋氨酸残基(R17ERM20RRAEPA26)的两亲性 α-螺旋、酸性区(E62-65)或多聚脯氨酸螺旋(P69/72/75/78)可降低它在MHCⅠ转运方面的活性，阻断Nef与MHCⅠ细胞质尾部结构域的结合。

HIV Nef降低MHC-Ⅰ中人类白细胞抗原A、B (human leukocyte antigens-A、B，HLA-A、HLA-B)在感染细胞表面的表达，从而减少病毒抗原在HIV感染细胞表面的暴露，避免HIV感染的细胞被HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)的识别和杀伤［16］。HIV Nef不影响HLA-C和HLA-E的表达［17］。这些分子向自然杀伤(natural killer cell，NK)细胞提供适当的抑制信号，以逃逸NK细胞的杀伤。因此，Nef可在适应性和先天性细胞免疫两个方面保护HIV感染的细胞。

2.2 Nef对CD4的影响

CD4蛋白是HIV感染的辅助受体。由于细胞膜上存在的CD4可降低新生病毒颗粒出芽和离开感染细胞的能力，减少病毒的感染性，因此，HIV感染细胞后，细胞表面的CD4对病毒具有不利影响。HIV-1通过两种蛋白即Vpu和Nef对抗这一效应［18］。目前认为，Nef对于CD4向细胞表面的转运无显著影响，但可明显缩短细胞表面CD4分子的半衰期。

Nef的这一功能可能是通过与CD4细胞质尾部结合而实现的。NMR结构分析表明［9］，Nef核心结构域的疏水袋与CD4胞质尾部的13个氨基酸肽段(QIKRLLSEKKT)具有直接的相互作用。这一相互作用在体外相当弱(解离常数为1 mmol/L)，但十分特异，因为肽段中双亮氨酸膜体的断裂可以破坏这种作用［9］。有研究［19］表明，全长Nef与CD4细胞质尾部结构域形成的复合体更加稳定，解离常数约为0.5 mmol/L，由此提示，Nef蛋白氨基端其他的氨基酸也参与了与CD4的相互作用。然而，体内检测到Nef与CD4的相互作用并不需要双亮氨酸模体的参与，可能还有其他因素参与这种相互作用［20］。

Nef羧基端弹性袢中有3个结构域与Nef下调CD4的能力有关，即双亮氨酸模体(EXXXLL165)和2个酸性模体(EE155和DD175)。双亮氨酸模体和双天门冬氨酸模体的作用已经明确，其中之一发生突变可完全破坏Nef的活性。

2.3 Nef介导的CD28下调

T细胞受体(T cell receptor，TCR)功能的发挥需要辅助分子如CD28所传递的辅助刺激信号。研究［21］表明，TCR或CD28与配体单独结合仅能激活少量T细胞，造成一种无能状态。除下调CD4以外，Nef也能够加速辅助刺激分子CD28的内化。基因和功能研究［22］显示，Nef介导的CD28内吞作用需要衔接蛋白2(adaptor protein 2，AP2)参与，由Nef，AP2和CD28直接相互作用所引起，Nef的这一作用是一种保守现象。Nef的LL165/166和His194残基对于下调CD28具有关键作用。

CD28分子下调对于病毒的益处尚不明确，一种假说［22］认为，通过下调CD28，病毒能够阻止T细胞激活。CD28和B7分子之间、TCR/CD4和MHCⅡ类分子之间的相互作用对于稳定和维持T细胞与抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APCs)间紧密而又持久的相互作用，具有十分重要的意义。Nef介导的C28和CD4下调可减弱T细胞与APC细胞之间的相互作用促进，感染的T细胞进入血液循环，以及向其他APC细胞运动，从而增强病毒的传播［22］。此外，通过下调CD28，Nef可降低感染T细胞和APC之间的信号传导或干扰正常的TCR启动信号。此效应对于阻断激活诱导的凋亡十分重要。由于Nef可激活特定的下游效因子如活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)，替代正常信号级联反应［22］，因而，尽管CD28被异常下调，但感染的细胞仍能维持于激活状态，导致T细胞激活与抗原提呈脱节。

2.4 Nef介导的MHCⅡ类分子下调

MHCⅡ蛋白表达于所有抗原提呈细胞中，发挥向CD4+T细胞提呈抗原肽的作用。在慢性感染的单核细胞中，MHCⅡ抗原提呈受到阻碍，HIV-1 Nef可影响MHCⅡ蛋白在细胞表面的定位，减少外源性肽段向CD4+细胞的提呈［23］。

Nef蛋白通过两种机制破坏MHCⅡ抗原提呈，其中包括下调成熟MHCⅡ在细胞表面的表达以及上调MHCⅡ相关的恒定链(invariant chain，Ii)在细胞表面的表达。与Ii的上调相比，成熟MHCⅡ的下调所需Nef的浓度较高［23］。双亮氨酸模体(LL165/166)和酸性模体(EDE174～176)对于Nef诱导的CD4下调和Ii上调十分关键，75和78位脯氨酸突变可阻断MHCⅠ和MHCⅡ下调，但对于Ii上调没有影响［24］。这些结果揭示Nef下调MHCⅡ的详细机制，这一功能在抑制病毒特异性T细胞免疫方面具有重要作用。

2.5 Nef对病毒感染性和复制能力的影响

研究［24］显示，采用HeLa-CD4-LTR-β-半乳糖苷酶标志的细胞系感染试验中，Nef+HIV-1比Nef-HIV-1感染的细胞多5～20倍;在单轮感染试验中，Nef突变的原病毒DNA生产的病毒颗粒的感染性比野生型病毒株降低4～40倍。Nef缺陷株的传染性可通过在产生病毒的细胞中加入表达Nef的质粒而得以加强。

Nef可通过增加宿主淋巴细胞数量而促进病毒复制。NFAT是一种在协调T细胞激活方面发挥重要作用的转录因子。据Manninen A等［25］报道，Nef可诱导产生NFAT的生成，Nef对于T细胞的这种作用为钙/钙神经素通路所调节，并与Ras通路相协同。在静止的CD4+T淋巴细胞中，NFAT的异常表达可诱导出一种容许状态，在这种状态下，尽管缺少有关T细胞激活方面的证据，但HIV仍然可以在这些细胞中复制。

发动蛋白2对于Nef增加病毒感染性是必需的。据Massimo A等［26］报道，采用RNA干扰技术敲除发动蛋白2后可抑制Nef增加病毒感染性的能力。对于发动蛋白2敲除的细胞，外源性表达发动蛋白2可补救Nef的这一功能。Nef诱导的病毒感染性增加尚依赖于包涵素，因为在包涵素敲除的细胞或表达AP18的细胞中，Nef的这一功能明显降低，甚至完全受到抑制。

2.6 Nef对细胞凋亡的影响

Nef可诱导感染的和未感染的免疫效应细胞发生凋亡。在感染的细胞中，Nef诱导HIV特异性细胞毒性T细胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)自杀相关因子(factor associated suicide，Fas，CD95)和 Fas配体(CD95L)的表达，凋亡信号的激活导致HIV特异性CTL凋亡，从而出现免疫逃逸。Nef可通过c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和核因子-κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号传导通路诱导凋亡，氨基末端豆蔻酰化破坏或R106A突变后，Nef丧失诱导凋亡的能力［27］。

Nef可增强宿主细胞耐受Fas和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α介导的凋亡，改变病毒感染细胞的胞内微环境。HIV病毒可使感染T细胞表面FasL表达增加［28］，促进邻近的CTL凋亡，从而保护感染的细胞。为了阻止FasL和TNF-α诱导感染的细胞发生未成熟死亡，Nef与细胞内凋亡信号调节激酶(apoptosis signal-regulating kinase，ASK1)结合，从而抑制Fas介导的细胞凋亡，保护感染细胞免于凋亡。

Nef也可通过Bad抑制死亡信号传导，Bad是B细胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)蛋白家族中促凋亡成员之一，其表达受HIV诱导，在线粒体水平调控细胞凋亡［29］。Nef介导的磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和p21活化蛋白激酶(p21-activated protein kinases，PAK)激活可导致Bad磷酸化，引起抗凋亡蛋白Bcl-XL从Bad/Bcl-XL复合体中释放出来，增加细胞的存活和病毒的复制［29］。

此外，Nef也可通过氨基末端(1～57位氨基酸残基)直接结合肿瘤抑制因子P53，降低P53蛋白的半衰期、DNA结合能力及转录活性，从而抑制HIV-1感染的细胞发生P53介导的细胞凋亡。具体机制可能是通过激活P21激活的激酶和PI3K而阻止细胞凋亡通路。

3 结论

Nef作为HIV附属蛋白之一，是相对分子质量较小的豆蔻酰化蛋白，Nef的柔韧性相对较大，具有一些保守模体，这些模体是Nef发挥多种功能的结构基础。

Nef蛋白通过下调 CD4，MHCⅠ，MHCⅡ和CD28分子的表达，在对抗宿主免疫应答方面发挥重要作用。Nef在T细胞中可启动转录，增强病毒的复制和感染性。Nef蛋白也通过抑制外源性和内源性死亡信号而促进感染细胞的存活。

在感染的细胞中Nef作为衔接蛋白募集信号传导复合体，在HIV致病机制方面发挥关键作用。

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