低温碱性蛋白酶高产菌株的选育与发酵条件研究

全桂静， 尹黎献

(沈阳化工大学环境与生物工程学院，辽宁沈阳110142)

低温碱性蛋白酶是一类最适温度为15℃，最适pH值为碱性的蛋白酶，主要应用于加酶洗涤剂，在制革、丝绸等工业有广泛的用途［1］.目前加酶洗涤剂中主要添加的是中温碱性蛋白酶，其最适温度一般都在50℃以上，而自来水的温度一般都在30℃以下，洗涤时必须采用加热的水，给日常生活造成不便.若洗衣粉中加入低温蛋白酶，则可直接用自来水洗涤，既方便又节约能量.在能源紧缺的地区，一般都不会用温水洗涤，添加低温碱性蛋白酶的洗涤剂将有很好的应用前景和市场潜力［2］.

微生物低温碱性蛋白酶的研究主要在近20年，产低温碱性蛋白酶的微生物主要集中在一些极端环境中，如深海的水和泥，深海的鱼和贝，以及冰川、高山、南极和北极的水和泥中，，主要有假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、异单胞菌属(Alteromonas)等［3－5］.选育优良生产菌株是提高低温碱性蛋白酶产量、降低成本的主要条件.本文由性状优良的枯草芽孢杆菌出发［6－8］，选育低温碱性蛋白酶高产菌株，并对发酵条件进行初步优化.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，购于中国普通微生物学保藏中心，实验室传代保藏.

1.1.2 培养基配方［2，9］

富集培养基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，牛肉膏5，pH=8.5.酪蛋白培养基(g/L):干酪素10，琼脂20，pH=10.种子培养基(g/L):NaCl5，牛肉膏3，蛋白胨10，pH=7.2～7.4.发酵培养基(g/ L):蛋白胨5，酵母粉3，葡萄糖5，pH=8.5.

1.2 实验方法

1.2.1 菌种诱变

用3 mL无菌水洗下培养24 h的枯草芽孢杆菌斜面上的细胞，倒入含玻璃珠的无菌三角瓶中充分振荡将细胞打散，制成单细胞悬液.

将菌悬液置于无菌培养皿，在15 W紫外灯的诱变箱中诱变120 s［10］，加入3 mL加倍牛肉膏蛋白胨液体培养基混匀，用黑纸包裹培养皿，于37℃恒温培养箱中培养2 h，取菌悬液划线于酪蛋白培养基平板上，于20℃下恒温培养48 h.

1.2.2 菌种复筛

用接种环取一环初筛得到的菌株，接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min，恒温振荡培养48 h，进行蛋白酶活力测定.

1.2.3 粗酶液活力测定

发酵液于低速离心机4 000 r/min离心10 min，去除细菌细胞，收集上清液作为粗酶液进行酶活性测定.

低温碱性蛋白酶活性采用紫外法测定［2，11］.对照氨基酸标准曲线换算出酪氨酸的量［12］.

酶活力的定义为20℃、pH=8.0条件下，每分钟催化酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需的酶量为一个单位U［11］.

1.2.4 低温碱性蛋白酶生产条件的研究

营养条件研究:以常用糖类及无机、有机含氮化合物分别作为碳源和氮源，50 mL三角瓶中装20 mL液体培养基按5%比例接种，在30℃，180 r/min的条件下恒温振荡培养24 h，测定酶活.

发酵条件优化:在确定营养条件基础上，考察各种因素对低温碱性蛋白酶生产的影响，以优化发酵条件.

正交实验设计:根据单因素实验结果，设计4因素3水平的正交实验，见表1.正交实验的验证实验:按以上正交实验结果的最优配比进行发酵重复实验.

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 结果与讨论

2.1 低温碱性蛋白酶生产菌株的筛选

经紫外诱变后得到10株产低温碱性蛋白酶的菌株，经过5次传代后得到4株性状比较稳定的菌株.液体发酵24 h，测定蛋白酶活力，结果见图1.由图1可知3号菌株产酶的能力最强.选择3号菌株作为出发菌株，将菌株编号为B.Sub 3.

图1 初筛菌株的蛋白酶活力Fig.1 Proteases of early screening strains

2.2 产酶条件的优化

2.2.1 碳源对产酶的影响

培养基的碳源种类对产酶有一定的影响，不同碳源对产酶的影响见图2.从图2可以看出:以葡萄糖为碳源时发酵液的酶活力最高;以甘油为碳源时产酶量最低.

图2 碳源对产酶的影响Fig.2 Effect of carbon source on the productivity of enzyme

2.2.2 氮源对产酶的影响

考察蛋白胨、硫酸铵、牛肉膏、硝酸钾及酪素等不同含氮物质对发酵产酶的影响，结果见图3.由图3可知:不同氮源对产酶的影响不大，产酶的最佳氮源为蛋白胨，酪素次之，牛肉膏最低.

图3 氮源对产酶的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on the productivity of enzyme

2.2.3 pH值对产酶的影响

确定最佳碳源和氮源后，考察pH值对产酶的影响，结果见图4.由图4可以看出:pH值对菌株产酶的影响较大，产酶的最佳pH值为8.0，酶活可以达1 896 U/mL，在pH值为7.0时细菌的产酶最差，酶活仅为1 500 U/mL.在pH值为5.5～7之间时，酶活随pH值的增大而减小，pH值在7～7.5时酶活随着pH值的增大而增大，当pH值达到8.5时，不适应菌株的生长，所以酶活有所降低.

图4 初始pH值对产酶的影响Fig.4 Effect of initial pH on the productivity of enzyme

2.2.4 温度对产酶的影响

利用确定的培养基条件，接种后分别在20℃，25℃，30℃，35℃，40℃下发酵培养，培养24 h后测定其酶活.结果见图5.从图5可以看出温度对产酶的影响较大.产酶的最佳温度为30℃，酶活为2 240 U/mL.在温度为25℃时酶活最低，酶活为2 195 U/mL.

图5 温度对产酶的影响Fig.5 Effect of temperature on the productivity of enzyme

2.2.5 发酵时间对产酶的影响

将上面确定的培养基分别置于30℃下摇床培养20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h，测定其酶活，结果见图6.由图6可以得出产酶的最佳发酵时间为28 h，发酵时间为30 h时酶活最低.发酵时间低于28 h，酶活随着发酵时间的增大而增大，当发酵时间高于28 h时，蛋白酶的酶活又降低.原因是发酵时间过少细菌还未达到稳定期，处在延滞期或者指数期，细胞内的初生代谢产物还未达到最大值，产酶量也未达到最大值.发酵时间过长，培养基中的营养物质消耗殆尽，细菌将分解蛋白酶等物质为其提供能量，细胞内分解代谢大于合成代谢，导致酶活降低.

图6 发酵时间对产酶的影响Fig.6 Effect of fermentation time on the productivity of enzyme

2.2.6 正交实验结果

根据单因素实验结果，以葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，进行4因素3水平的正交实验来确定最佳培养基，正交实验结果如表2所示.

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，A2B2C3D2为优化组合，酶活可达到2 120 U/mL;由极差R可以看出，培养基的初始pH值对产酶的影响最大，其次分别为蛋白胨浓度，装液量，温度.适合B.Sub 1发酵生产低温蛋白酶的培养基配方为葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，pH=8.0;发酵条件为32℃，50 mL三角瓶装液量为20 mL发酵32 h.

2.2.7 正交实验的验证实验结果

按上述正交实验最优配比:0.5%的蛋白胨，pH=8.0，温度为32℃，装液量为20 mL/50 mL三角瓶，进行4组平行实验，结果见表3.由表3可知:在此条件下蛋白酶的最高活力是2 231 U，最低的为2 149 U，说明选育得到的菌株性能比较稳定.目前，低温碱性蛋白酶的研究较少，与枯草芽孢杆菌发酵生产碱性蛋白酶［8］相比，发酵液的酶活力相当或略高，具有深入研究的价值.

表3 正交实验验证实验结果Table 3 Results of the demonstration test about orthogonal test

3 结论

通过诱变筛选，共得到5株低温碱性蛋白酶的生产菌株.利用250 mL摇瓶液体发酵完成复筛，得到产低温碱性蛋白量最高的一株枯草芽孢杆菌，且将其命名为B.sub 3.该菌株的最佳产酶培养基配方为:葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，pH值为8.0;发酵条件为:50 mL三角瓶中装20 mL液体培养基，接种比例为5%，培养温度为32℃，培养时间为28 h，发酵液中低温碱性蛋白酶活力可以达到2 231 U/mL.

［1］ 薛林贵.我国碱性蛋白酶的应用及研究发展［J］.微生物学通报，1997，24(6):370－371.

［2］ 万琦，陆兆新，高宏.低温碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件的研究［J］.微生物学杂志，2002，22 (5):16－18，24.

［3］ 杨胜远，陆兆新.微生物低温碱性蛋白酶的研究进展［J］.食品与发酵工业，2004，30(4):93－98.

［4］ 张锐，曾润颖.极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件的研究［J］.微生物学通报，2001，28 (4):5－9.

［5］ 吕明生，陈静，王淑军，等.海洋细菌产低温碱性蛋白酶菌株筛选研究［J］.江苏食品与发酵，2004 (1):7－10.

［6］ 马明，杜金华.枯草芽孢杆菌酶在工业生产中的应用［J］.山东科学，2006，19(3):36－38.

［7］ 邱秀宝，程秀兰，袁影.嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究［J］.微生物学通报，1988，15(3):101－104.

［8］ 姚刚，程建军，孙鹏，等.枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的研究［J］.食品科学，2009，30(23):347－351.

［9］ 那淑敏，余茂效.一株产碱性蛋白酶菌株的选育及其发酵条件的研究［J］.微生物学报，1988，28(3): 129－133.

［10］鞠华伟，江连洲，王秋京，等.高产碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌菌株选育及其水解条件的研究［J］.食品工业科技，2007，28(8):109－111.

［11］张龙翔，张庭芳，李令媛，等，生化实验方法和技术［M］.2版.北京:高等教育出版社，1996:177－178.

［12］房丽华，张健，仲伟珍，等.海洋低温碱性蛋白酶的刺激性研究［J］.海洋水产研究，2000，21(4):94－101.

［13］Gerday C，Aittaleb M，Arpigny J L，et al.Psychrophilic Enzymes:A Themodynamic Challenge［J］.Biochi.Biophy.Acta，1997，1342(2):119－270.

［14］Hoshino T，Ishizaki K，Sakamoto T，et al.Isolation of a Pseudomonas Species from Fish Intestine that Produces a Protease Active at Low Temperature［J］.Lett.Appl.Microbiol.，1997，25(1):70－72.