RP-HPLC法测定人血浆中帕瑞昔布的浓度

李正翔，尹静文，孙丽

（1.天津医科大学总医院，天津市 300052；2.泰山医学院药学院，泰安市 271016；3.天津医科大学药学院，天津市 300070）

RP-HPLC法测定人血浆中帕瑞昔布的浓度

李正翔1＊，尹静文2，孙丽3

（1.天津医科大学总医院，天津市 300052；2.泰山医学院药学院，泰安市 271016；3.天津医科大学药学院，天津市 300070）

目的：建立测定人血浆中帕瑞昔布的方法。方法：采用反相高效液相色谱法，血浆以无水乙醚提取后进样测定，色谱柱为Kromasil C18，流动相为乙腈-水（92∶8），内标为布洛芬，流速为1.0mL·min－1，检测波长为209nm，最小进样间隔为30min。结果：帕瑞昔布血药浓度在73.69～442.16μg·mL－1范围内线性关系良好（r＝0.9992）；方法回收率为97.26%～99.24%，提取回收率为79.27%～80.51%，日内和日间RSD均≤2.10%。结论：本方法简便、快速、准确、重复性好，可以满足帕瑞昔布血药浓度的测定要求。

反相高效液相色谱法；帕瑞昔布；血药浓度；药动学

非甾体抗炎药（NSAIDs）通过抑制环氧化酶（COX），以减少花生四烯酸转化成前列腺素（PG）等炎症介质，达到抗炎镇痛的目的，是目前疼痛治疗的常用药物[1]。非选择性的NSAIDs，虽能同时阻滞COX-1和COX-2，起到抗炎和止痛作用，但其胃肠道损害、肾脏损害和抑制血小板聚集等不良反应却限制了其进一步使用。口服选择性的COX-2抑制剂如塞来昔布和罗非昔布（几年前默克制药公司在全球自愿召回罗非昔布（万络））能有效缓解中度疼痛，减少胃肠道反应和抗血小板作用等不良反应的发生，但对术后恶心、呕吐以及不能口服药物的患者也不是理想选择[2，3]。因此，帕瑞昔布——一种可以通过静脉注射或肌肉注射途径使用的特异有效COX-2抑制剂，可能是最佳选择[4～6]。帕瑞昔布2008年底开始在中国上市，之前只有美国和印度有相关的使用记录。在国内，该药的临床药动学数据还相对缺乏。因此，需要建立一种快速、简便、准确的测定该药血药浓度的方法。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate 3000高效液相色谱仪及其工作站（戴安中国有限公司）；UV-260紫外检测仪（日本岛津公司）；800型离心沉淀器（上海手术器械厂）；LD5-2A离心机（北京医用离心机厂）；KQ218型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；YKH-Ⅲ型液体快速混合器（江西医疗器械厂）；CP225D型电子天平（德国Sartorius公司）；通用型Adventurer分析天平（美国Ohaus公司）；YQ02.30型直联旋片式真空泵（上海长江医疗器械厂）；101-A型数显电热鼓风干燥箱（上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司）；BS60电热三用水箱（北京医疗器械厂）。

1.2 试药

对照品：注射用帕瑞昔布钠（辉瑞制药有限公司，批号：AGUKB-85820001，含量：100.5%）；内标：布洛芬（中国药品生物制品检定所，批号：100.79-200303）；正常人空白血浆（天津医科大学总医院输血科提供）；氮气（N2，六方高科技气体厂，含量：99.999%）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯，纯化水为天津医科大学总医院药剂科自制。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（250nm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（92∶8）；检测波长：209nm，流速：1.0mL·min－1；柱温：室温；进样量：20μL；最小进样间隔：30min。

2.2 血浆样品及溶液的制备

2.2.1 血浆样品。将已加抗凝剂的正常血液置离心机上1500r·min－1离心10min，使血细胞与血浆分离，取上层血浆置于冰箱－20℃保存。使用时，室温自然融化。

2.2.2 帕瑞昔布钠对照品溶液。取干燥至恒重的注射用帕瑞昔布钠约0.1g，准确称定为0.12221g（含帕瑞昔布钠0.12282g），置于100mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.2282mg·mL－1帕瑞昔布钠对照品溶液，置于2℃冰箱备用。用前闭塞超声2min。

2.2.3 内标溶液。取内标布洛芬约0.05g，准确称定为0.05161g，置于50mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.0324mg·mL－1的内标溶液，置于2℃冰箱备用。用前闭塞超声2min。

2.3 正交试验确定血浆样品的处理方法

2.3.1 预试验：取空白血浆0.5mL，依次加入帕瑞昔布钠对照品溶液0.1mL、0.10mol·mL－1盐酸溶液适量、内标（1.0324mg·mL－1布洛芬）溶液0.1mL、乙醚适量。涡旋振荡10min，1500r·min－1离心2min，取上清液于40℃水浴下N2挥干后，残渣加入0.10mol·mL－1氢氧化钠溶液，超声溶解后，再次于60℃水浴下N2挥干，残渣加入流动相2mL超声溶解后，取20μL，按“2.1”项色谱条件进样测定。结果，帕瑞昔布和内标出峰时间均较适宜，且能达到良好的分离。

2.3.2 试验方案。根据预试验情况，确定考察因素为血浆样品的pH值（A）（用盐酸调节），加入的氢氧化钠的体积与盐酸体积的差值（B），乙醚量（C），每个因素安排3个水平进行优选，试验因素与水平见表1。

表1 试验因素水平Tab1 Factors and levels

2.3.3 试验结果。以确定的3因素3水平，按照L9（34）正交表的设计配制9份样品，以帕瑞昔布的峰面积为指标，进行评定。正式试验结果见表2。

表2 正交试验结果L9（34）Tab2 Results of L9（34）orthogonal test

如表2所示，通过极差分析可知，几个因素对结果影响大小的顺序是 C＞B＞A，且 A 因素：K1＞K2＞K3，B 因素：K1＞K3＞K2，C 因素：K2＞K1＞K3。所以最佳提取条件是 A1B1C2，即调节pH＝1、加碱量少于加酸量0.5mL、加乙醚4mL。

2.3.4 血浆样品提取方法的确定。根据正交试验，血浆样品的处理方法为：取血浆0.5mL，用0.10mol·mL－1盐酸调节pH值至1，加入内标（1.0324mg·mL－1布洛芬）溶液0.1mL，乙醚4mL，涡旋振荡10min，1500r·min－1离心2min，取上清液于40℃水浴下N2挥干后，残渣加入0.10mol·mL－1氢氧化钠（比盐酸量少0.5mL），超声溶解后，再次于60℃水浴下N2挥干，残渣加入流动相2mL超声溶解后，取20μL进样。

2.4 专属性考察

吸取帕瑞昔布钠对照品溶液0.12mL，加入到空白血浆0.5mL中，摇匀，配制成浓度为294.77μg·mL－1的血浆样品。按“2.3.4”项下方法处理进样，并与血浆样品及空白血浆比较，结果，血浆中的内源性物质不干扰帕瑞昔布和内标的测定。帕瑞昔布、内标布落芬的保留时间分别为3.00、4.05min。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+帕瑞昔布对照品溶液+内标；C.血浆样品+内标；1.帕瑞昔布；2.布洛芬Fig1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+parecoxib control+internal standard；C.plasma sample+internal standard；1.parecoxib；2.ibuprofen

2.5 标准曲线的制备

吸取帕瑞昔布钠对照品溶液0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18mL，分别加入到空白血浆0.5mL中，摇匀，使其浓度分别为73.69、147.39、221.08、294.77、368.46、442.16μg·mL－1。按“2.3.4”项下方法处理，进样测定，记录色谱。用帕瑞昔布峰面积与内标峰面积比（Y）对浓度（c）作线性回归，得回归方程Y＝0.0089c+0.2101（n＝5，r＝0.9992）。结果表明，帕瑞昔布血药浓度在73.69～442.16μg·mL－1范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

吸取0.06、0.12、0.18mL的帕瑞昔布钠对照品溶液，分别加入到空白血浆0.5mL中，摇匀，配制成浓度分别为147.39、294.77、442.16μg·mL－1的血浆样品。按“2.3.4”项下方法处理，每个浓度的样品分别于同日内等时间间隔5次和连续5d内5次提取进样，测定，将所得峰面积比值（Y）用标准曲线计算出帕瑞昔布浓度（c），考察日内和日间精密度，结果见表3。

表3 精密度试验结果（n＝5）Tab3 Results of precision tests（n＝5）

2.7 提取回收率试验

按“2.6”项下方法，配制3种浓度的血浆样品，按“2.3.4”项下方法处理，进样测定，记录色谱。将所得峰面积比值（Y），用标准曲线计算出帕瑞昔布浓度（c）。另相同浓度的帕瑞昔布钠对照品溶液直接进样后，将所得峰面积比值（Y′），根据标准曲线计算出帕瑞昔布浓度（c′）。用c与c′的比值计算提取回收率，结果见表4。

表4 提取回收率试验结果（n＝5）Tab4 Results of extraction recovery tests（n＝5）

2.8 加样回收率试验

取空白血浆0.5mL，向其中加入帕瑞昔布钠对照品溶液，配制成低、中、高3种浓度的血浆样品。再分别向其中加入相当于血浆样品含药量80%、100%、120%的帕瑞昔布钠对照品溶液，各平行制备5份，按“2.3.4”项下方法处理，记录色谱。所得峰面积比值（Y），根据标准曲线计算出帕瑞昔布浓度（c），进而得到测得量。按公式（加样回收率＝（测得量－血浆样品中帕瑞昔布量）/对照品加入量×100%）计算加样回收率，结果见表5。

表5 加样回收率试验结果（n＝5）Tab5 Results of recovery tests（n＝5）

2.9 稳定性试验

按“2.5”项所示，配制成浓度为294.77μg·mL－1的血浆样品9份。放置于－20℃冰箱，分别于0、24、72h后自然解冻，每个间隔3个样品，按“2.3.4”项下方法处理，测定，结果测得浓度分别为（326.25±9.38）、（313.54±13.68）、（317.54±5.4）μg·mL－1，其RSD＝2.04%。表明血浆中帕瑞昔布在－20℃条件下中稳定。

3 讨论

3.1 提取方法对色谱行为的影响

本试验采用了液-液萃取的方法。由于所用药品帕瑞昔布钠为水溶性的药物，故先将其酸化降低极性后，再用乙醚提取，可有效增大提取回收率；之后，再用氢氧化钠碱化，挥干，可有效降低杂质峰对帕瑞昔布峰的影响，并且改善峰形。本试验通过正交试验，得出用盐酸调节样品至pH＝1、加入的氢氧化钠比盐酸少0.5mL最为适宜。

3.2 色谱条件对色谱行为的影响

3.2.1 检测波长的选择。将对照品稀释100倍，用紫外检测仪在200～400nm范围内扫描，发现在209nm和243nm波长处均有较大吸收，209nm波长处为最大吸收，因此选择209nm为检测波长。

3.2.2 内标的选择。笔者考察了布洛芬，结果显示，帕瑞昔布钠在C18柱上的保留时间为3.0min左右，布洛芬的保留时间为4.0min左右，和帕瑞昔布峰的分离度（R）为5.5，分离效果较好，且布洛芬的出峰位置无杂质峰干扰，符合生物样品的测定要求。

3.2.3 流动相的选择。考虑到价格因素，笔者尝试了用甲醇作流动相，但帕瑞昔布峰的峰面积不随浓度的增大而成倍增加，可能的原因是甲醇极性较低，帕瑞昔布钠在其中的溶解程度较低，不能得到良好的分离洗脱。对于流动相的配比，笔者分别用乙腈-水（92∶8）、乙腈-水（95∶5）、乙腈-水（90∶10）、乙腈-水（88∶12）作为流动相进行试验。结果，用乙腈-水（95∶5）作流动相，帕瑞昔布钠与前面杂质峰不能分开；用乙腈-水（88∶12）作流动相，帕瑞昔布钠与后面杂质峰不能分开；用乙腈-水（90∶10）作流动相，分离效果较好，但帕瑞昔布钠峰形较钝，均不符合测定要求。而用乙腈-水（92∶8）作流动相，峰形较好，且能达到良好的分离。

3.2.4 进样间隔时间考察。笔者发现在26min左右还有峰出现，因此把最小进样间隔时间定为30min。

3.3 对照品选择

由于帕瑞昔布标准品无法获得，所以采用已知含量的注射用帕瑞昔布钠作为试验对照品，文中所用数据均为经标示量百分含量折算后的数值。

本试验以布洛芬为内标，采用无水乙醚提取挥干后进样的反相高效液相色谱法测定人血浆中帕瑞昔布浓度。在流动相为乙腈-水（92∶8）、流速为1.0mL·min－1、检测波长为209nm、最小进样间隔为30min的色谱条件下，帕瑞昔布线性范围为73.69～442.16μg·mL－1，线性关系良好，提取回收率较高，准确度和精密度较高。该法简便、快速、准确、重复性好，可用于帕瑞昔布血药浓度的测定。

[1] Baigent C，Patron C.Selective cyclooxygenase-2inhibitors aspirin and cardiovascular disease[J].Arth&Rheum，2003，48（1）：12.

[2] Tindall E.Celecoxib for the treatment of pain and inflammation：the preclinical and clinical result[J].JAOA，1999，99（Suppl 11）：S13.

[3] Chan CC，Boyce S，Brideau C，et al.Rofecoxib［Vioxx，MK-0966：4-（4’-methyls ulfonylphenyl）-3-phenyl-2-（5H）-furanone］：a potent and orally active cyclooxygenase-2inhibitor.Pharmacological and biochemical profiles［J］.J Pharmacol Exp Ther，1999，290（7）：551.

[4] 何 薇，孙 源，卜一珊.非甾体解热镇痛药的临床应用进展[J].天津药学，2004，16（5）：60.

[5] 王 宁，黄世杰.一种镇痛新药帕瑞昔布[J].国外医学·药学分册，2002，29（1）：12.

[6] 封宇飞，雷 静，吕俊玲.特异性环氧酶-2抑制剂——帕瑞昔布[J].中国临床药理学杂志，2003，19（3）：207.

Concentration Determination of Parecoxib in Human Plasma by RP-HPLC

LI Zheng-xiang
（General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China）
YIN Jing-wen
（School of Pharmacy，Taishan Medical College，Taian 271016，China）
SUN Li
（School of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the concentration determination of parecoxib in human plasma.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The plasma sample was extracted with absolute ether.The determination was performed on Kromasil-C18（250nm×4.6nm，5μm）column with mobile phase consisted of acetontrile-water（92∶8）at the flow rate of 1.0mL·min－1.Ibuproren（IBF）was used as internal standard and UV detection wavelength was set at 209nm.Minimum injection interval was 30min.RESULTS：The linear range of parecoxib was 73.69～442.16μg·mL－1（r＝0.9992）.The method recovery was 97.26%～99.24%and extraction recovery was 79.27%～80.51%.The RSD of intra-day and inter-day were less than 2.10%.CONCLUSION：The method is simple，rapid，accurate，reproducible and suitable for the determination of parecoxib concentration in human plasma.

RP-HPLC；Parecoxib；Plasma concentration；Pharmacokinetics

R969.1；R971+.1

A

1001-0408（2011）18-1675-03

＊主任药师。研究方向：医院药学。电话：020-60363702。E-mail：Lee41@sina.com

2010-07-06

2011-03-01）