盐酸甲氯芬酯胶囊在健康人体内的生物等效性研究

华卡，李健和，朱运贵，易利丹，曹俊华，刘晓磊，阳巧凤，曾小慧，罗霞

（1.湖南省脑科医院药剂科，长沙市 410007；2.中南大学湘雅二医院药学部，长沙市 410011；3.湖南省马王堆医院，长沙市 410016）

盐酸甲氯芬酯胶囊在健康人体内的生物等效性研究

华卡1＊，李健和2#，朱运贵2，易利丹2，曹俊华3，刘晓磊2，阳巧凤2，曾小慧2，罗霞2

（1.湖南省脑科医院药剂科，长沙市 410007；2.中南大学湘雅二医院药学部，长沙市 410011；3.湖南省马王堆医院，长沙市 410016）

目的：研究2种盐酸甲氯芬酯胶囊在中国健康志愿者体内的生物等效性。方法：18名健康男性志愿者随机分为2组，分别单剂量交叉口服盐酸甲氯芬酯胶囊受试制剂或参比制剂200mg。于服药前0h和服药后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、14、24h时抽取静脉血，采用高效液相色谱法测定血浆中对氯苯氧乙酸的浓度。通过DAS Ver 2.0软件计算主要药动学参数，评价2制剂的生物等效性。结果：盐酸甲氯芬酯受试制剂与参比制剂的药动学参数分别为：tmax（2.11±0.37）、（2.06±0.34）h，cmax（12.56±2.85）、（12.78±2.84）μg·mL－1，t1/2（5.81±2.68）、（6.00±2.14）h，AUC0～24（34.11±7.89）、（34.12±7.99）μg·h·mL－1，AUC0～∞（34.83±7.68）、（34.79±7.97）μg·h·mL－1。以AUC0～24计算，受试制剂对参比制剂的相对生物利用度为（100.7±11.7）%。 结论：2种盐酸甲氯芬酯胶囊在中国健康志愿者体内具有生物等效性。

盐酸甲氯芬酯胶囊；对氯苯氧乙酸；高相液相色谱法；生物等效性

盐酸甲氯芬酯是中枢兴奋药，其化学名为对氯苯氧乙酸二甲氨基乙酸盐，临床主要用于治疗外伤性昏迷、酒精中毒、新生儿缺氧症、儿童遗尿症等[1～4]。2005年版《中国药典》二部[5]和有关文献[6～9]采用高效液相色谱（HPLC）法测定其制剂的含量，但仅见少量文献报道人血浆中甲氯酚酯测定方法[10]。因甲氯芬酯在体内的代谢产物为对氯苯氧乙酸，且在体内较稳定，故本试验建立一种简单、灵敏和快速的HPLC法测定18名中国健康志愿者口服盐酸甲氯芬酯胶囊受试制剂与参比制剂后血浆中对氯苯氧乙酸的浓度，计算药动学参数和相对生物利用度，评价2制剂的生物等效性。

1 材料

1.1 仪器

1100 系列高效液相色谱仪，包括化学高级色谱数据工作站（美国Agilent公司）AL-204电子分析天平（瑞典Mettler Toledo公司）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；HY-4多用调速振荡器（江苏金坛市医用仪器厂）；GL-88B旋涡混合器（江苏海门麒麟医用仪器厂）。

1.2 试药

受试制剂：盐酸甲氯芬酯胶囊（湖南华纳大药厂有限公司，规格：每粒100mg，批号：20081206）；参比制剂：盐酸甲氯芬酯胶囊（广东先强药业有限公司，每粒100mg，批号：20080902）；对氯苯氧乙酸对照品（厦门星隆达化工有限公司，含量：99.0%）；甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为双重蒸馏水。空白血浆由中南大学湘雅二医院血液科提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：汉邦 C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30）；检测波长：254nm；流速：1.0mL·min－1；进样量：20μL；柱温：25℃。

2.2 受试者选择

健康男性志愿者18名，年龄（23.2±1.2）岁，身高（171.0±3.4）cm，体重（61.4±4.0）kg，试验前进行体格检查，血尿常规、肝肾功能、心率、血压和心电图等检查均正常；试验者既往体健，无药物过敏史，无吸烟、嗜酒及经常用药史。2周内未服用任何可能影响本品吸收、代谢的药物。试验期间统一清淡饮食，不使用除受试制剂和参比制剂以外的任何药物，不接受烟、酒及含咖啡的饮料，避免剧烈运动。受试者试验前签署知情同意书，本试验方案经湖南省脑科医院医学伦理委员会审核批准。

2.3 试验方案

采用双周期自身随机交叉试验设计。18名受试者随机等分为2组，每组受试者每次试验时分别服用盐酸甲氯芬酯胶囊受试制剂或参比制剂。受试者于试验前1日晚餐后，禁食不禁水12h，次日清晨空腹分别单剂量口服含盐酸甲氯芬酯200mg的受试制剂或参比制剂，以250mL温开水送服，并作记录。服药2h后可自由饮水，服药4h后进统一标准餐。试验期间由医护人员进行监护。间隔7d后交叉给药，重复上述试验。分别于服药前0h和服药后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、14、24h时由前臂肘静脉取血5mL。血样置于肝素化的离心管中，立即离心（3000r·min－1）5min，分离出血浆，置－20℃冰箱中保存备用。

2.4 标准溶液的制备

准确称取对氯苯氧乙酸对照品10mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1000µg·mL－1的对氯苯氧乙酸贮备液。用甲醇将此贮备液稀释成浓度为100、10、1µg·mL－1的系列对照品溶液，均置于4℃冰箱中保存，备用。

2.5 血浆样品处理

精密吸取血浆样品0.2mL于离心管中，加入乙腈0.7mL，涡流混旋3min，以 16000r·min－1离心3min。取上清液20μL进样分析。

2.6 专属性考察

空白血浆、对氯苯氧乙酸对照品溶液、空白血浆+对氯苯氧乙酸对照品溶液以及健康受试者血浆样品，经HPLC分析测定得到色谱图见图1。对氯苯氧乙酸保留时间约为4.1min，峰形良好，基线平稳，无杂峰干扰测定，表明本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中对氯苯氧乙酸的浓度。

2.7 标准曲线与定量下限

取离心管数支，分别精密加入不同量的对氯苯氧乙酸对照品溶液后以氮气流吹干，加入空白血浆0.2mL，涡旋混匀1min，配成血浆中含对氯苯氧乙酸分别为0.047、0.141、0.47、1.41、4.70、14.1、28.2µg·mL－1的标准系列浓度，按“2.5”项下方法操作，每一浓度进行5样本分析，进样20μL，记录色谱图及对氯苯氧乙酸峰面积。以对氯苯氧乙酸峰面积平均值（A）对血药浓度（c）进行回归运算，得回归方程为：A＝9.2886×c+0.3433（r＝0.9969），结果表明对氯苯氧乙酸血药浓度在0.047～28.2µg·mL－1浓度范围线性关系良好。定量下限为0.047µg·mL－1。

2.8 精密度及回收率试验

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.对氯苯氧乙酸对照品溶液；C.空白血浆+对氯苯氧乙酸对照品溶液；D.受试者血浆样品；1.对氯苯氧乙酸Fig1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.chlorophenoxyacetic acid standard solution；C.blank plasma+chlorophenoxyacetic acid standard solution；D.plasma sample of the subjects；1.chlorophenoxyacetic acid

取离心管数支，于离心管中精密加入不同量的对氯苯氧乙酸对照品溶液适量，以氮气流吹干后，精密加入空白血浆0.2mL，涡旋混匀1min，配成含对氯苯氧乙酸0.141、1.41、4.1µg·mL－1的血浆，按“2.5”项下方法操作，每种浓度平行做15份样品（3d 3批次），并与标准曲线同批进行测定，以当日的标准曲线计算对氯苯氧乙酸浓度，考察方法的准确度与精密度，结果表明其准确度与精密度符合药动学研究的方法学要求。精密度及回收率试验结果见表1。

表1 精密度及回收率试验结果Tab1 Results of precision and recovery test

2.9 绝对回收率试验

取离心管数支，分别取对氯苯氧乙酸对照品溶液适量于离心管中，用甲醇配成含对氯苯氧乙酸浓度分别为0.141、1.41、14.1µg·mL－1的溶液，每份0.2mL，以氮气流吹干后，精密加入双重蒸馏水0.2mL和乙腈0.7mL溶解残渣，精密吸取20μL进样分析，记录色谱图和峰面积（As）。另取离心管数支，于离心管中精密加入不同量的对氯苯氧乙酸溶液适量，以氮气流吹干后，精密加入空白血浆0.2mL，涡旋混匀1min，配成含对氯苯氧乙酸浓度分别为0.141、1.41、14.1µg·mL－1的血浆样品，每种浓度各做5份样品，加入乙腈0.7mL，涡旋混匀3min，于16000r·min－1离心3min，精密吸取20μL上清液进样分析，记录色谱图和峰面积（Ai）。对氯苯氧乙酸的绝对回收率＝Ai/As×100%。测定结果见表1。

2.10 稳定性试验

取干净离心管数支，按“2.7”项下方法制备含对氯苯氧乙酸浓度分别为0.141、1.41、14.1μg·mL－1的标准含药血浆，每个浓度各平行制备5份，共15份，1份配制好后按“2.5”项下方法操作后，立即进样分析；1份血样室温放置4h后提取操作；1份提取后于4℃自动进样器放置10h后进样分析；1份于冰箱中冷冻保存1个月后取出，解冻后提取操作；1份在1个月内反复冻融3次后提取操作。结果显示上述考察条件下所有样品的测定值与添加值的RSD均＜15%，说明分析测试过程中各个条件下的样品均较为稳定。

2.11 数据处理

受试制剂与参比制剂的cmax和tmax均以实测值表示；AUC0～t以梯形法计算；AUC0～∞按公式计算：AUC0～∞＝AUC0～t+ct/λZ（t为最后一次可实测血药浓度的采样时间；ct为末次可测样本药物浓度；λZ为对数药-时曲线末端直线部份求得的末端消除速率常数）；t1/2用公式t1/2＝0.693/λZ计算。以各个受试者服用受试制剂与参比制剂的AUC0～t按下式分别计算其相对生物利用度（F）值：F＝AUC受试制剂/AUC参比制剂×100% 。主要药动学参数经对数转换后以多因素方差分析（ANOVA）进行显著性检验，然后用双单侧t检验和计算90%置信区间的统计分析方法来评价和判断药物间的生物等效性。药动学基本参数的计算与统计学检验统计分析借助DAS Ver2.0软件完成。

2.12 血药浓度测定结果及药动学参数

18名受试者口服盐酸甲氯芬酯胶囊受试制剂或参比制剂200mg后的平均药-时曲线见图2。受试者口服盐酸甲氯芬酯胶囊受试制剂或参比制剂200mg后的主要药动学参数见表2。对同一受试者2种制剂的药动学参数进行配对t检验，差异均无统计学意义（P＞0.05）。以参比制剂为标准对照，受试制剂的相对生物利用度为（100.7±11.7）%。

图2 18名健康志愿者单剂量口服盐酸甲氯芬酯受试制剂或参比制剂后的平均药-时曲线Fig2 Mean plasma concentration-time curves of meclofenoxate hydrochloride in 18healthy volunteers after single oral dose of Meclofenoxate hydrochloride capsules

表2 18名健康志愿者单剂量口服盐酸甲氯芬酯受试制剂或参比制剂后的主要药动学参数Tab2 Main pharmacokinetic parameters of meclofenoxate hydrochloride in 18healthy volunteers after single oral dose of Meclofenoxate hydrochloride capsules

2.13 生物等效性评价

受试制剂和参比制剂的Cmax、AUC经对数转换后进行方差分析，并进一步采用双单侧t检验和（1－2α）置信区间法进行生物等效性评价，tmax采用非参数检验法。结果表明：对氯苯氧乙酸的 AUC0～t、AUC0～∞和ρmax均拒绝生物不等效假设（P＞0.05）；受试制剂的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信区间分别为参比制剂相应参数的96.48%～122.90%、97.64%～111.99%和97.81%～111.73%；非参数检验结果显示，2制剂的tmax差异无统计学意义（P＞0.05）。根据以上结果，判定2制剂生物等效。

2.14 不良反应或事件

整个试验过程由经《药物临床试验管理规范》（GCP）培训的临床医师和护士进行观察，18名受试者在服用含盐酸甲氯芬酯200mg的受试制剂或参比制剂后均无不适主诉，亦未观察到不良事件，且均按要求完成试验。

3 讨论

本文建立了测定人血浆中对氯苯氧乙酸浓度的HPLC法，预处理简单、快速，血样干扰少。线性关系和样品稳定性均良好，其方法的精密度和准确度均能符合药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则对生物样品分析的要求，测定结果可靠。

国外有关盐酸甲氯芬酯药动学的研究未见报道，国内有采用毛细管电泳-电化学检测法间接测定人血浆中盐酸甲氯芬酯的报道[10]。18名试验者单剂量口服盐酸甲氯芬酯胶囊200mg的受试制剂或参比制剂后，AUC0～t的个体间差异较大，但制剂间、周期间差异无统计学意义。

由于该试验的研究对象均为健康男性，且为单剂量给药，人群范围太窄，年龄均较年轻化，故结果不能代表和推断出老年人群的给药指数。

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Bioequivalence Study of Meclofenoxate Hydrochloride Capsule in Healthy Volunteers

HUA Ka
（Dept.of Pharmacy，Hunan Provincial Brain Hospital，Changsha 410007，China）
LI Jian-he，ZHU Yun-gui，YI Li-dan，LIU Xiao-lei，YANG Qiao-feng，ZENG Xiao-hui，LUO Xia
（Dept.of Pharmacy，The Second Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410011，China）
CAO Jun-hua
（Mawangdui Hospital of Hunan Province，Changsha 411016，China）

OBJECTIVE：To evaluate the bioequivalence of two kinds of Meclofenoxate hydrochloride capsule in Chinese healthy volunteers.METHODS：18healthy male volunteers were randomly divided into 2groups and given single oral dose of meclofenoxate test preparation or reference preparation 200mg.The blood samples were collected at 0h，and 0.33，0.67，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，14，24h after adiministrotion.The concentration of chlorophenoxyacetic acid in plasma was determined by HPLC.The pharmacokinetic parameters were calculated and the relative bioequivalence was evaluated by DAS Ver 2.0software.RESULTS：The main pharmacokinetic parameters of trial capsules vs.reference capsule of meclofenoxate hydrochloride were as follows：tmax（2.11±0.37）h vs.（2.06±0.34）h；cmax（12.56±2.85）μg·mL－1vs.（12.78±2.84）μg·mL－1，t1/2（5.81±2.68）h vs.（6.00±2.14）h；AUC0～24（34.11±7.89）μg·h·mL－1vs.（34.12±7.99）μg·h·mL－1；AUC0～∞（34.83±7.68）μg·h·mL－1vs.（34.79±7.97）μg·h·mL－1，respectively。The relative bioavailability of test capsule was（100.7±11.7）%.CONCLUSION：Two kinds of meclofenoxate hydrochloride capsules are bioequivalent in Chinese healthy volunteers.

Meclofenoxate hydrochloride capsule；Chlorophenoxyacetic acid；HPLC；Bioequivalence

R969.1；R971+.7

A

1001-0408（2011）18-1669-04

＊副主任药师。研究方向：医院药学。电话：0731-85232243。E-mail：hkcsy2008@126.com

#通讯作者：副主任药师，硕士。研究方向：新药研发。电话：0731-85292093。E-mail：lijianhexy@126.com

2010-08-09

2010-10-30）