雷米普利拉和氯沙坦单用及联用对小鼠心肌缺血-再灌注损伤的心肌保护作用比较

冉玉华，刘新友

（1.第四军医大学附属唐都医院药剂科，西安市 710033；2.军事医学科学院毒物药物研究所心血管药理研究室，北京市 100850）

雷米普利拉和氯沙坦单用及联用对小鼠心肌缺血-再灌注损伤的心肌保护作用比较

冉玉华1，2＊，刘新友1#

（1.第四军医大学附属唐都医院药剂科，西安市 710033；2.军事医学科学院毒物药物研究所心血管药理研究室，北京市 100850）

目的：观察血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）雷米普利拉与血管紧张素Ⅱ受体拮抗药（ARB）氯沙坦单用及联用对心肌缺血-再灌注损伤模型小鼠心肌的保护作用。方法：将32只C57BL/6小鼠随机均分成4组，包括对照组（生理盐水）、氯沙坦（8mg·kg－1）组、雷米普利拉（50μg·kg－1）组和氯沙坦+雷米普利拉（8mg·kg－1+50μg·kg－1）组，建立心肌缺血-再灌注损伤模型，于再灌注前5min静脉推注给药。术中监测相关指标如动脉血压、左室重量/体重（LVW/BW）、危险区域/左室重量比（AR/LV）、心率等，之后处死小鼠，对组织进行染色观察，以心肌梗死面积/危险区域（IS/AR）值作为保护心肌组织的检测指标。结果：各组小鼠动脉血压、LVW/BW、AR/LV和心率等无显著性差异；雷米普利拉和氯沙坦单用及联用组IS/AR值分别为（21.8±2.3）%、（20.8±3.2）%和（18.4±2.4）%，与对照组（39.6±2.0）%相比具有显著性差异（P＜0.05），但单用组与联用组比较未见统计学差异。结论：雷米普利拉和氯沙坦均对小鼠心肌缺血-再灌注损伤具有心肌保护作用，但2药联用作用并不优于2药单用。

氯沙坦；雷米普利拉；心肌缺血-再灌注损伤；小鼠；心肌保护

肾素血管紧张素系统（Renin angiotensin system，RAS）在心肌缺血时被激活，使血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）合成增加，加重心肌损伤的发生。AngⅡ可以通过血管紧张素转换酶（Angiotensin-converting enzyme，ACE）依赖性途径和ACE独立的途径合成[1]。ACE抑制剂（ACEI）和AngⅡ受体拮抗药（Angiotensin receptor blocker，ARB）通过抑制AngⅡ生物合成以及阻断AngⅡ受体水平降低全身RAS活性，从而改善心肌梗死患者的预后[2]。近年来有研究[3，4]表明，ACEI减少缺血再灌注-损伤（IRI）后心肌梗死面积的机制与其降低内源性激肽（Kinin）的降解有关，而与AngⅡ合成无关。在动物实验中，ACEI如雷米普利拉（Ramiprilat）[4]和ARB如氯沙坦（Losartan）[5]均可发挥药物后适应作用，降低再灌注心肌梗死面积，而组织激肽释放酶（Tissue kallikrenin，TK）-kinin系统可能是ACEI和ARB心肌保护作用的共同通路。比较单独应用ACEI类药物雷米普利拉和ARB类药物氯沙坦及其两者联用是否可以发挥不同的心脏保护作用、两者联用是否能协同增加对抗IRI的作用在国内少见文献报道。本实验拟在小鼠心肌IRI的模型中，观察雷米普利拉联合氯沙坦对心肌的保护作用，为心脏保护的临床药物选用提供实验学依据。

1 仪器、材料与方法

1.1 动物

C57BL/6小鼠，2周龄，♂，体重（25±10）g，购自维通利华动物中心，动物合格证号090814。

1.2 试药

雷米普利拉原料药（华海药业股份有限公司，纯度：＞99%）；氯沙坦片（默沙东制药有限公司，规格：每片50mg）；染色剂氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）、伊文氏蓝、戊巴比妥钠均购自美国Sigma公司，纯度均为化学纯。

雷米普利拉和氯沙坦按照要求的浓度用生理盐水制备成相应的溶液。

1.3 仪器

RM-6000八导生理记录仪（日本光电株氏会社）；无创型大小鼠尾压心率测定仪（中日友好医院）；电子天平（德国Sartorius公司）。

1.4 分组与小鼠心肌IRI模型的建立

将32只小鼠随机均分成4组，包括对照组生理盐水（1μL·g－1），氯沙坦（8mg·kg－1）组，雷米普利拉（50μg·kg－1）组，氯沙坦（8mg·kg－1）+雷米普利拉（50μg·kg－1）组。再灌注前5min，静脉推注单次给药。氯沙坦和雷米普利拉的给药剂量经人用临床用药剂量换算而得。

小鼠称重后，戊巴比妥钠（60mg·kg－1）腹腔注射，麻醉后气管插管接呼吸机（潮气量4～8mL，呼吸比5∶4，呼吸频率90次/min），同时监测体温并利用加热板维持肛温在37℃，连接八导生理记录仪记录心电图变化情况，实施左侧开胸术暴露心脏，移除心包，利用8.0的聚丙烯缝合线对离左心房顶端2mm处的冠状动脉左前降支进行结扎，持续缺血30min后松开结扎处缝合线，恢复血流。左心室出现红色血流和正常心电图（Electrocardiogram，ECG）说明再灌注成功。恢复肺部通气，关胸，再灌注3h。

1.5 颈动脉血压测定

小鼠建模后，保持小鼠体温在37℃。行气管切开术，将连接到八导生理记录仪的导管插入左颈动脉对血压进行监测，10min后对血压和心率进行实时连续的记录，并观察比较受试药物给予前、后1个心动周期中动脉血压的平均值的差值，记为ΔMAP值。

1.6 小鼠生理指标的监测

包括小鼠处死前体重（Body weight，BW）、处死后检测得到的左室重量/体重（Left ventricle weight/body weight，LVW/BW），危险区域/左室重量比（Area at risk/left ventricle，AR/LV）以及再灌注过程中心率（Heart rate，HR）的变化，记录再灌注1、2、3h的心率值，分别记为HR1、HR2、HR3。

1.7 心肌组织学检测

利用TTC染色剂进行病理染色。再灌注3h后，重新开胸再次阻断冠状动脉。5%的伊文氏蓝溶液0.5mL通过颈静脉推注进入，心肌组织中不会被伊文氏蓝染色的部分称为AR。心脏和LV先后被分离，称重，从基底到顶端横断面连续切割成4片，保证第1切面在冠状动脉闭塞处。切片用2%的TTC溶液在37℃的条件下染色20min，然后置于10%的福尔马林溶液中浸泡24h，观察梗死面积（Infarct size，IS，此区域不会被TTC染色），在imagine pro-plus软件中进行成像和定量分析，可以观察到该部分的灰度。缺血心脏组织IS重量之和与AR的绝对重量的百分比采用切片中梗死面积之和所对应的重量占所有AR切片重量的百分比表示，以此检查药物对心肌IRI的保护作用。

1.8 统计方法

实验数据用均值±标准误表示，利用Sigma stat软件进行方差分析进行统计处理，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉血压

各组小鼠ΔMAP值结果详见图1。

图1 各组小鼠动脉血压的变化情况（n＝8）Fig1 Changes of arterial pressure in each group（n＝8）

由图1可见，雷米普利拉组和氯沙坦组均可显著降低小鼠动脉血压。但是，在给药后10～20min所记录的ΔMAP值中，各药物治疗组与对照组相比并无统计学差异；另，2药联用组与2药单用组比较，降压效应并无显著性差异。

2.2 生理指标

各组小鼠的BW、LVW/BW、AR/LV以及HR的变化见表1。

表1 各组小鼠生理指标检测结果（n＝8）Tab1 Physiological index of mice in each group（n＝8）

由表1可见，各组小鼠生理指标值比较无统计学差异。

2.3 心肌组织学

各组IS/AR结果详见图2。

图2 各组小鼠IS/AR比较（n＝8）与对照组比较：＊P＜0.05Fig2 Comparison of IS/AR in each grou（pn＝8）vs.control group：＊P＜0.05

图2结果显示，雷米普利拉和氯沙坦组小鼠IS/AR值分别为（21.8±2.3）%和（20.8±3.2）%，与对照组（39.6±2.0）%比较具有显著差异。2药联合组（18.4±2.4）%虽然与对照组比较亦显示出具有显著的心脏保护作用，但与2药单用组比较并无显著性差异。

3 讨论

本实验采用结扎小鼠冠状动脉前降支建立心肌IRI模型是研究心肌IRI的经典模型。结果各组小鼠AR/LV及心率无显著性差异，提示实验中模型建立具有稳定可靠、造模成功率高的优点。雷米普利拉和氯沙坦都有降低小鼠平均动脉压的作用趋势，但2种药物合用并不显著增加药物的降压作用，没有统计学差异，可以推测2药对心肌的保护作用与其降血压作用并没有直接的相关性，而可能涉及到其他的途径和通路：ACEI阻断ACE依赖性的AngⅡ合成；ARB阻断AT1受体，可在ACEI的基础上进一步阻断系统RAS的活性[1]。但在IRI的心肌保护作用研究中，TK-kinin系统与ACEI和ARB的后适应作用关系更密切[5]。采用TK基因敲除小鼠，雷米普利拉[4]和氯沙坦[5]降低心肌IS的保护作用被完全阻断。这提示TK是介导ACEI类药和ARB类药心肌保护作用的共同的关键蛋白分子。TK催化Kininogens为kinin，后者通过缓激肽B2受体可增加冠脉血流、降低心肌氧化应激等，从而发挥心肌保护作用[6]。

对于心肌IRI后心肌IS大小的测定可直接反映出心肌细胞的损伤程度和范围。而IS/AR比值的降低则说明药物具有保护心肌组织的能力。雷米普利拉和氯沙坦均可显著降低心肌IS，二者具有相似的心肌保护作用，但二者联用并没有显示出比单药治疗更好的心肌保护作用。依据本实验的研究设计，尚无法对结果的相关机制予以解释，相关研究有待进一步深入开展。ARB虽然可在ACEI的基础上进一步阻断系统RAS的活性，但结果表明对RAS活性的进一步抑制与阻断AngⅡ的合成存在平行的作用关系，而不是协同效应。本实验仅仅从ACEI和ARB类中选取了1种药物进行比较，存在一定的局限性。然而心脏保护机制存在多种途径和方式，从任何一个角度或者单一环节阻断心肌梗死的病理生理进程，都会对其起到一定的保护作用，关于心肌梗死的机制和相关药物靶点的研究开发有待继续进行。雷米普利拉和氯沙坦作为目前临床运用广泛的药物，本实验为此2种药物的临床使用提供了更加广阔的实验治疗学依据。

[1] Hollenberg NK，Fisher ND，Price DA.Pathways for angiotensinⅡ generation in intact human tissue：evidence from comparative pharmacological interruption of the renin system[J].Hypertension，1998，32（3）：387.

[2] Pfeffer MA，McMurray JJ，Velazquez EJ，et al.Valsartan，captopril，or both in myocardial infarction complicated by heart failure，left ventricular dysfunction，or both[J].The New England Journal of Medicine，2003，349（20）：1893.

[3] Martorana PA，Kettenbach B，Breipohl G，et al.Reduction of infarct size by local angiotensin-converting enzyme inhibition is abolished by a bradykinin antagonist[J].European Journal of Pharmacology，1990，182（2）：395.

[4] Griol-Charhbili V，Messadi-Laribi E，Bascands JL，et al.Role of tissue kallikrein in the cardioprotective effects of ischemic and pharmacological preconditioning in myocardial ischemia[J].Faseb J，2005，19（9）：1172.

[5] Messadi-Laribi E，Griol-Charhbili V，Pizard A，et al.Tissue kallikrein is involved in the cardioprotective effect of AT1-receptor blockade in acute myocardial ischemia[J].The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2007，323（1）：210.

[6] Sharma JN.Role of tissue kallikrein-kininogen-kinin pathways in the cardiovascular system[J].Archives of Medical Research，2006，37（3）：299.

Protective Effect of Ramiprilat or Losartan Alone and Their Combination against Myocardium Ischemia-reperfusion Injury in Mice

RAN Yu-hua，LIU Xin-you
（Dept.of Pharmacy，Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University，Xi’an 710033，China）
RAN Yu-hua
（Dept.of Cardiovascular Pharmacology，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE：To observe the protective effect of ACEI ramiprilat or ARB losartan alone and their combination against myocardium ischemia-reperfusion injury in mice.METHODS：32C57BL/6mice were randomly divided into four groups including control group（normal saline），losartan group（8mg·kg－1），ramiprilat group（50μg·kg－1）and losartan+ramiprilat（8mg·kg－1+50μg·kg－1）group.Myocardium ischemia-reperfusion injury model was established by intravenous push for 5min before reperfusion.Physiological index were monitored during the process，such as arterial pressure，LVW/BW，AR/LV and heart rate.Mice were sacrificed and brain tissue was observed by staining using IS/AR as index.RESULTS：There were no significant differences in arterial pressure，LVW/BW，AR/LV and heart rate.IS/AR of ramiprilat or losartan alone and their combination were（21.8±2.3）%，（20.8±3.2）%and（18.4±2.4）%，respectively，which is significant different from（39.6±2.0）%of control group（P＜0.05）.There was no significant difference between single therapy group and combination therapy group.CONCLUSION：Ramiprilat and losartan have protective effect against myocardium ischemia-reperfusion injury.But combination therapy is not prior to single therapy.

Losartan；Ramiprilat；Myocardium ischemia-reperfusion injury；Mice；Cardio-protection

#通讯作者：副主任药师。研究方向：结肠靶向药物和药动学。电话：029-84777716。E-mail：lxylxywy@fmmu.edu.cn

R965；R972+.4

A

1001-0408（2011）17-1566-03

＊实习研究员，博士研究生。研究方向：心血管分子药理学。电话：010-68216087。E-mail：phscyhr@tom.com

2011-01-05

2011-02-23）