2010年福建省手足口病患者中柯萨奇B5病毒的序列分析＊

翁育伟，周朝晖，陈 炜，郑奎城，严延生

2010年福建省手足口病患者中柯萨奇B5病毒的序列分析＊

翁育伟1，2，周朝晖2，陈 炜2，郑奎城2，严延生2

目的了解福建省手足口病患者中CVB5（Coxsackie virus B5）病毒的变异及进化特征。方法采集2010年福建省手足口病例呼吸道标本，经RD细胞分离肠道病毒。病毒分离上清用于RNA提取并经RT－PCR法鉴定病毒型别。对鉴定为其他肠道病毒（非EV71或CVA16）的病毒，扩增病毒完整VP1区，扩增产物经克隆、筛选后测序。应用Mega软件对病毒VP1序列进行比较和种系进化分析。结果从2010年福建省手足口病患者中扩增得到6株完整的VP1区序列，序列比对证实有4株CVB5病毒，其他2株为Echo9病毒。序列差异比较表明，分离自福建省的CVB5病毒一致性程度较高，在种系进化上处于独立的进化分支，而与国内其他省份或其他国家的CVB5病毒分离株比较则有较大差异。结论2010年福建省手足口病患者中存在CVB5病毒的感染，病毒与既往其它省份分离株有较大差异，提示CVB5病毒在福建省具有独特的传播链。

手足口病；柯萨奇B5；种系分析

手 足 口 病 （Hand－Foot－Mouth Disease，HFMD）是由多种人肠道病毒（Human enterovirus，HEV）引起的一种急性传染病，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状，少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等中枢神经系统症状，个别重症病例可导致死亡。肠道病毒型别复杂，所致临床症状多样。除肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A16型（Coxsackie virus A 16，CVA16）为HFMD的主要病原体外，其他肠道病毒血清型，如柯萨奇 A 组病毒中的CVA2、4、5、6、9、10型，柯萨奇B组病毒的1－5型以及埃可病毒（Echovirus，E）中的E6、E9、E13、E25、E30等也可导致 HFMD或者无菌性脑炎、脑炎、麻痹等神经系统症状［1－3］。2010年，福建省在HFMD的病原学监测中发现了4例CVB5病毒感染病例，为了解这些病例中CVB5病毒的特征，我们对上述CVB5病毒的主要结构蛋白VP1进行了序列测定和分析。

1 材料与方法

1．1 材料 HFMD病毒呼吸道标本来自于HFMD监测哨点医院。用于病毒分离的RD细胞为本单位保存。病毒RNA提取试剂、一步法RTPCR试剂盒以及PCR产物纯化试剂均为Qiagen公司产品。TA克隆试剂盒、感受态细胞等购自Ta KaRa公司。引物（见表1）合成及序列测定由Ta KaRa公司完成。

1．2 方法

1．2．1 病毒分离 感染者呼吸道标本的采集和处理按中国疾病预防控制中心下发《手足口病监测方案（2010年版）》。人横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD）细胞用含10%胎牛血清的细胞生长液（MEM）传代，长满单层后经胰酶消化，接种于斜面细胞培养管，置36℃、5%CO2培养，长至成80%～90%单层后，吸弃细胞生长液，更换成含2%胎牛血清的细胞维持液2 m L，接入处理好的标本200μL，继续培养至第7 d，每天观察细胞病变情况。如7 d内产生明显细胞病变，则收集上清冻于－70℃，无细胞病变的取上清再盲传一代。

表1 病毒鉴定引物及VP1区扩增使用的引物一览表Tab．1 Primers used for viral identification and amplification of VP1 gene

1．2．2 病毒RNA提取和RT－PCR鉴定 收集病毒分离物，冻融3次后，10 000 r／min离心5 min。取上清140按Qiagen RNA mini kit说明书提取病毒RNA。病毒RNA洗脱于50洗脱液，－70℃保存备用。采用Qiagen One－step RT－PCR反应盒试剂盒做病毒型别鉴定。配置RT－PCR反应体系：5×buffer 5μL，d NTP（10mmol／L）1μL，上下游引物（10μmol／L）各1μL，酶混合物1μL，DEPC－treated H2O补足到20μL，加入5μL病毒RNA至总体积为25μL。按下列反应程序进行扩增：42℃反转录45 min；95℃灭活10 min；95℃，30 s；50 ℃，30 s；72℃，30 s；共35循环扩增，72℃，10 min后4℃保温。分别使用引物 EV71－F／EV71－R，CVA16－F／CVA16－R和PE1／PE2做EV71、CVA16以及其他肠道病毒的鉴定。RT－PCR产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳后观察。

1．2．3 病毒VP1区的扩增、片断克隆及序列测定将上述鉴定为非EV71和非CVA16的其他肠道病毒培养物按上述方法提取RNA后，应用008／009引物扩增病毒的VP1区。除使用引物不同外，RTPCR反应体系同上。按下列反应程序进行扩增：50℃反转录30 min；95℃灭活15 min；95℃，40 s；50℃，40 s；72 ℃，1 min；共35循环扩增，72 ℃，10 min后4℃保温。产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳后，按QIA Gel extraction试剂盒说明，回收纯化目的条带，置－20℃备用。纯化后的扩增产物按试剂盒说明克隆至p MD－18T载体，转化DH5α感染态细胞，筛选阳性克隆后交Ta KaRa公司测序。

1．2．4 CVB5病毒VP1区基因序列分析 应用DNAStar软件对病毒序列进行拼接，经Blast程序在GenBank中作序列比对确定病毒血清型。从GenBank下载CVB5病毒完整VP1序列，应用Clustal w对下载的序列和本研究获得VP1序列作多重排列，应用 Mega（version 3．1）软件，比较不同病毒株VP1序列的差异，并做种系进化分析（Neighbor－Joining法）。

2 结 果

2．1 病毒分离与鉴定 应用RD细胞分离和RTPCR法，从2010年福建省手足口病监测哨点医院送检的标本中分离其他肠道病毒（非EV71或CVA16）共14株。

2．2 病毒VP1区的扩增 应用008／009引物对扩增其中6株病毒的VP1基因片段，回收产物经TA克隆到p MD18T载体后测序。VP1序列测定和blast比对表明，其中4株病毒为CVB5，另外2株为Echo9。4例CVB5病毒感染病例情况见表2。

表2 4例CVB5感染手足口病病例信息Tab．2 Information of 4 patients infected with CVB5 in Fujian Province

2．3 病毒VP1序列分析 不同地区和时间病毒分离株的VP1区序列比较表明，2010年福建省分离的4株CVB5病毒的核苷酸差异为1．17%（0．12%～2．16%），氨基酸的差异为0．55%（0～1．07%）。与浙江、山东以及韩国等地不同时间分离的CVB5病毒比较，福建省CVB5病毒与上述分离株的VP1区核酸的差异为4．93%～6．52%，而氨基酸的差异为0．64%～1．74%，见表3。与上述病毒VP1区氨基酸序列相比，福建分离株在VP1蛋白95位氨基酸为N，而其他参与比较的分离株在该位置则为S。2．4 种系进化分析 以VP1区序列做种系进化分析，全球不同地区和年度CVB5病毒至少可以分为2群（Linage，L），其bootstrap值分别为95和99。其中L1群病毒在亚洲和欧洲国家具有分布，而L2群病毒仅在欧洲国家（法国、白俄罗斯、英国等）流行。福建省CVB5病毒属于L1群，但与国内山东、浙江以及韩国等地的病毒处于不同的分支上（Bootstrap值前者为99，后者为98），见图1。

3 讨 论

CVB5病毒属于肠道病毒B组成员（Human enterovirus B species），在遗传上与猪水泡病毒（Swine Vesicular disease virus，SVDV）相 似［10］。CVB5病毒感染可导致无菌性脑膜炎［4－5，11］等多种疾病，是常见的人感染肠道病毒血清型。1970－2005年美国肠道病毒监测表明，CVB5是人肠道病毒感染最常见的的血清型之一［3］。CVB5在法国、德国等欧洲国家的流行也较常见［7－8］。在亚洲，Baek等对2005－2006年韩国忠清南道无菌性脑膜炎病例的流行病学和病毒特征研究表明2005年病例有25%以上为CVB5感染［6］。国内在上世纪90年代就发现中枢系统感染者中存在CVB5肠道病毒感染的现象［12］。浙江省在2008年病毒性脑膜脑炎病例中，分离到5株CVB5病毒［11］。2009年山东HFMD流行期间，有近1／5肠道病毒为 CVB5［13］。福建省2010年HFMD监测中，从包括1例重症病例在内的HFMD病例中分离到4株CVB5病毒。这些现象提示，在我国，CVB5可能成为除EV71、CVA16以外导致HFMD的又一重要肠道病毒血清型。

表3 CVB5病毒分离株VP1区序列差异分析Tab．3 Diversity of nucleotide and amino acid sequence in VP1 region of CVB5 isolates

图1 CVB5肠道病毒分离株VP1区序列种系进化分析Fig．1 Phylogenetic analysis of VP1 region of CVB5 isolates

肠道病毒VP1编码区在病毒分类和进化关系研究中具有重要意义［9］。我们对全球流行的CVB5病毒的VP1区的进化分析表明，不同国家和时期的CVB5病毒大致可以分为2个独立的进化群（Linage，L），其中L1群包括了CVB5原型株、上世纪90年代和2005年左右欧洲流行的毒株以及流行于韩国、中国等亚洲国家的CVB5病毒，而2003－2006年期间在法国、白俄罗斯等欧洲国家流行的毒株构成了L2群。值得注意的是，2010年福建省分离的CVB5病毒属于L1群，但与该群的其他毒株比较，4株病毒构成了一个相对独立的进化分支。VP1区核酸序列差异分析表明，山东、浙江以及韩国分离的毒株序列差异为0．18%～3．34%，而福建省CVB5分离株与上述毒株的差异为4．93%～6．52%，因此推断福建省CVB5的流行可能存在着不同于国内其他省份的传染源，但从病毒氨基酸序列比较表明，福建省CVB5病毒与其他省份和韩国等地的病毒差异不大，为0．64%～1．74%，较为明显的差异存在于VP1氨基酸序列的95位，福建省分离株在95位上为N，而其他省份以及韩国分离株则为S。上述结果提示，福建省CVB5病毒和其他省份以及韩国的CVB5分离株的抗原特征相似。

了解HFMD病例的病原谱和流行病学特征是HFMD防控工作的重要环节。目前，HFMD的病原体主要为肠道病毒EV71和CVA16，对其遗传进化特征的研究较多，而对HFMD病例中的其他肠道病毒的遗传进化特征则较少研究。由于其他肠道病毒在HFMD的病原谱中也占有相当的比例，因此做好HFMD防治工作，必须了解这些病毒的遗传进化、抗原变异等特征。基于此，本研究对福建省分离的CVB5病毒的主要抗原基因进行了遗传进化特征分析，为今后福建省HFMD的防治提供了基础资料。

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Phylogenetic analysis on Coxsackie virus B5 isolated from Fujian Province，2010

WENG Yu－wei，ZHOU Chao－hui，CHEN Wei，ZHENG Kui－cheng，YAN Yan－sheng

（Fujian Center for Disease Control and Prevention，Fuzhou 350001，China）

The aim was to explore the variance and phylogenetic features of Coxsackie virus B5（CVB5）isolated from hand－foot－mouth disease（HFMD）patients in 2010 in Fujian，China．The respiratory specimen from HFMD patients were collected and cultured on RD cells for viral recovery．Viral RNA was extracted form the supernatant of culture and used for viral typing by reverse－transcript PCR．The whole VP1 region of the CVB5 isolates was obtained by RT－PCR，and followed by cloning into plasmid and sequencing．The variance and phylogenetic relation between CVB5 isolates from Fujian and that from other provinces and counties were calculated by using Mega software．It was found that of 6 viral isolates from Fujian Province in 2010，four were identified as CVB5 and the others were Echo9．The sequence analysis indicated that the CVB5 isolates from Fujian shared higher identity and formed a distinct branch on the phylogenetic tree，whereas showed more difference when compared with isolates from other province in China and from other countries．These results demonstrated that CVB5 virus had emerged in HFMD patients in Fujian and the transmission chain of CVB5 virus in Fujian might be distinct from that from other provinces．

hand－foot－mouth disease；Coxsackie virus B5；phylogenetic analysis

R373．2＋3

A

1002－2694（2011）12－1086－04

＊福建省自然科学基金项目（No．2010J01115）资助

严延生，Email：yysh＠pub1．fz．fj．cn

1．福建医科大学，福州 350001；2．福建省疾病预防控制中心，福州 350001

2011－05－10；

2011－08－29