用多糖-破伤风类毒素结合苗制备抗流行性脑膜炎球菌多糖单克隆抗体

李佩珊，张春燕，李时君，陈妍，项美娟，李方和，张洪

(1.武汉大学第一临床学院药剂科，430060;2.华中科技大学同济医学院附属同济医院实验医学研究中心，武汉 430030)

荚膜多糖是细菌类疫苗(如脑炎球菌疫苗等)制备的重要物质之一，其抗体，尤其是单克隆抗体的研制是推动产品(诊断、分型及其抗体治疗产品)质量评价及其疫苗接种效果监测的重要物质基础［1-2］。由于分子结构简单且抗原性弱，此类多糖疫苗对相应疾病预防的效果欠佳，对应抗体尤其是单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)的制备亦因而受到较大的影响［3-4］。鉴于与载体(蛋白)的耦联能显著提升此类物质的免疫特性［5］，笔者所在单位曾进行A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖(Neisseria meningococcal serogroup A polysaccharide，GAMP)-破伤风类毒素(tetanus toxoid，TT)耦联物制备的研究。为方便对该制剂进行质量控制与生产监测，笔者在此基础上进行了抗GAMP单克隆抗体(抗GAMP mAb)制备，并对其相关特征进行了考核，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Sp2/0细胞由中国典型培养物保藏中心提供;RPMI1640培养基、新生牛血清、完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂等购自Gibco公司;聚乙二醇4000，次黄嘌呤(hypoxathine，H)、氨蝶呤(aminopterin，A)、胸苷(thymidine，T)、小鼠免疫球蛋白亚类检测试剂、羊抗鼠IgG(GAM)及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗鼠 IgG(GAM-HRP)，以及HRP等购自Sigma公司;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)试剂盒购自美国Pierce公司;染色体分析试剂(秋水仙素等)由华中科技大学同济医学院附属同济医院遗传学实验室馈赠;纯化GAMP抗原、TT、GAMPTT、基因重组乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)以及氢氧化铝［Al(OH)3］凝胶与BALB/c小鼠等由武汉生物制品研究所提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物免疫 取 GAMP及 GAMP-TT各适量(50 μg·mL-1)，加等体积弗氏完全佐剂混合，乳化后分别于实验组与对照组(每组15只，雌性，6～8周龄)BALB/c小鼠背部皮下作多点注射，每只小鼠每次注射 0.2 mL(5.0 μg)。2 周后取同上抗原，加等体积弗氏不完全佐剂乳化，背部皮下多点注射;间隔2周同上法做加强免疫共3次。于各次免疫后10 d采血，分离血清置－20℃冻存。

另取BALB/c小鼠1只，同上法以GAMP-TT结合物进行免疫，末次加强免疫改为以相同剂量抗原做腹腔注射，3 d后摘取脾脏做细胞融合。

1.2.2 杂交瘤细胞建株 采用常规聚乙二醇法融合，以有限稀释法进行克隆化，具体操作见文献［6］。

1.2.3 单克隆抗体的筛选 抗GAMP mAb的筛选与效价检测采用间接酶联免疫吸附法。主要实验步骤为采用GAMP(融合筛选)或GAMP-TT(克隆化筛选与效价滴定)包被酶标反应板(4℃放置过夜)，加入被筛选培养上清液反应(室温放置30 min)并洗涤，加入酶标记羊抗鼠IgG反应(室温放置30 min)并洗涤，以及加入HRP底物系统显色及其结果判读等。具体操作参照文献及本室常规［6］。

1.2.4 抗GAMP mAb的制备 抗GAMP mAb杂交瘤腹腔积液的制备采用降植烷诱导法;纯化采用辛酸-硫酸铵沉淀法;腹腔积液及纯化产物蛋白含量检测采用紫外比色法;产物纯度的鉴定采用Western blot;纯化产物的辣根过氧化物酶标记采用改良过碘酸盐氧化法。上述实验的具体操作按本室常规并参考相关文献。

1.2.5 杂交瘤细胞染色体鉴定 加入秋水仙素作阻断培养，以低渗法处理后制备标本滴片，染色，计数约50个染色体分布均匀而完整的杂交瘤细胞，并计算其染色体数目均值。

1.2.6 抗GAMP mAb的特异性鉴定 抗原替代实验与抗原中和实验参照既往文献报道［7］。具体操作如下，抗原替代实验:①以抗GAMP 2E7 mAb包被酶标反应板;②将GAMP及其他几种不同替代抗原稀释至5.0 μg·mL-1，加至各包被板各相应反应孔中，每一抗原加5孔，室温反应45 min，常规洗涤5次;③加入适宜浓度的抗GAMP mAb-HRP，室温反应45 min，常规洗涤5次;④按常规完成剩余酶联免疫吸附法操作。抗原中和实验:①以GAMP-TT包被酶标反应板;②根据预实验结果，将抗GAMP mAb-HRP稀释成2倍最适酶联免疫吸附浓度;③将几种不同中和抗原调整至相同的基础浓度(2.0 mg·mL-1)，并按表3做系列稀释;④在各抗原稀释孔中分别加入等体积抗GAMP mAb-HRP，置室温30 min;⑤将中和反应后的标本加入各相应的包被孔中;按常规完成剩余酶联免疫吸附法操作。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行数据统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 免疫原的评价与选择 采用GAMP-TT与GAMP对两组BALB/c小鼠进行免疫，以间接ELISA(GAMP包被)对其抗GAMP进行检测，并对两者免疫效果(几何平均效价)进行比较。实验结果见表1。根据表1结果，选择GAMP-TT作抗原，同法免疫用以制备抗GAMP mAb。

2.2 杂交瘤细胞株的建立

2.2.1 融合与杂交瘤细胞筛选 采用常规聚乙二醇法融合，间接酶联免疫吸附法作抗GAMP mAb筛选，经3次克隆化后获得1株分泌抗GAMP mAb的杂交瘤细胞(2E7)。不同时段该杂交瘤细胞的生长与分泌状况见表2。

2.2.2 腹腔积液制备及检测 将杂交瘤细胞调整至1×107·mL-1，将其注射到5只预先用降植烷处理过的BALB/c小鼠腹腔中，于接种后11～14 d分别采取腹腔积液，1500 r·min-1(r=17.9 cm)离心 10 min，取中层液体混合后分装，置－20℃冻存。5只小鼠腹腔积液采集量3.7～8.1 mL(平均5.42 mL);混合抗体腹腔积液总蛋白23.50 g·L-1;混合腹腔积液抗GAMP效价为1×10-8(间接酶联免疫吸附法)。

表1 2种不同抗原对BALB/c小鼠的免疫效果Tab.1 Results of BALB/c mice immunized with two different antigens

表1 2种不同抗原对BALB/c小鼠的免疫效果Tab.1 Results of BALB/c mice immunized with two different antigens

与对照组比较，*1P ＞0.05，*2P ＜0.01Compared with control group，*1P ＞0.05，*2P ＜0.01

表2 抗GAMP 2E7杂交瘤细胞的融合、克隆化及筛选Tab.2 Results of fusing，cloning and screening of anti-GAMP 2E7 hybridoma cells

2.3 杂交瘤细胞的染色体鉴定 采用秋水仙素阻断法对经3次克隆化后的2E7杂交瘤细胞做染色体计数检测，染色结果见图1。随机选取45个溶胀充分、染色体分布均匀的细胞进行计数，染色体数量在137～145 条之间，平均染色体数(139.73 ±2.16)条。

图1 抗GAMP mAb分泌2E7杂交瘤细胞的染色体检测Fig.1 Chromatic picture of 2E7 hybridoma cell that secreted anti-GAMP mAb

2.4 单抗的纯化与鉴定

2.4.1 单克隆抗体的纯化 取上述2E7杂交瘤细胞诱生的小鼠腹腔积液3.0 mL，以辛酸-硫酸铵沉淀法纯化;紫外比色法［以牛血清清蛋白(bovine serum albumin，BSA)作为参比］测定其纯化产物中蛋白质的含量。前后两次提取物 IgG浓度分别为1.76和2.32 mg·mL-1。采用间接酶联免疫吸附法对其进行检测，抗 GAMP 效价分别为2.56 ×106及5.12 ×106。

2.4.2 纯化产物的标记 采用改良过碘酸盐法对2E7 mAb提取产物做HRP标记，标记产物经盐析并透析后加甘油至40%，置－20℃冻存。采用直接酶联免疫吸附法进行测定，其标记产物效价为1/25600 。

取上述标记产物(抗GAMP mAb HRP)适量，采用40% 丙三醇将其稀释至效价为1/200，适量分装置－20℃冻存，临用时稀释。

2.4.3 产物纯度鉴定 采用SDS-PAGE对提取物进行进行鉴定，实验结果(图2)显示，提取物经SDS PAGE后显示两条染色区带，其相对分子质量分别约为75000 及45000 ，灰度扫描分析显示其纯度为97.6%。

图2 纯化抗GAMP E7 mAb纯度的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purity of anti-GAMP E7 mAb

2.4.4 抗GAMP 2E7 mAb的Ig亚类鉴定 采用胶体金免疫层析实验对抗GAMP 2E7培养上清液中Ig的类型与亚类进行鉴定，结果显示该杂交瘤细胞所分泌的抗体属IgG，其亚类为IgG1。

2.4.5 抗GAMP 2E7 mAb的特异性考核

2.4.5.1 抗原中和实验 采用前述方法做抗原替代实验，实验结果见表3［以中和孔吸光度值(A)/中和率(%)表示］。两种A群流脑菌多糖中和孔当抗原浓度在0.10 μg·mL-1时出现明显中和效果(中和率 ＞50.0%)，抗原浓度在10.00 μg·mL-1时基本达到完全中和。其余抗原替代孔中和反应呈阴性。

2.4.6 抗原替代实验 采用前述方法做抗原替代实验，分别采用 GAMP-TT、GAMP、TT、HBsAg、BSA 包被，各反应孔显色强度(A450)分别为2.67 ±0.065，2.04 ±0.132，0.045 ±0.043，0.032 ± 0.029，0.029 ± 0.031。可见，采用GAMP与GAMP-TT进行包被，各反应孔均呈阳性显色反应，但其显色强度(A450)以采用GAMPTT者为高，显色的可重复性亦明显高于采用GAMP包被孔。单纯TT包被及采用无关抗原包被组各反应孔未显示明确的阳性信号，其显示强度分别与GAMP及GAMP-TT两组相比均差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3 抗GAMP 2E7 mAb特异性考核抗原中和实验结果Tab.3 Result of specificity identification using neutralization assay that conjugated anti-GAMP 2E7 mAb

3 讨论

与普通多态性抗原相比，纯化后的细菌荚膜多糖在抗原性上存在较多缺陷［1-2］，通过与适当载体的结合，其免疫特征能得到极大改善［3-4］。这一现象作为疫苗制剂学中的一项重要发现，已被用于多种细菌多糖疫苗的制备，将其用于A群流脑菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗等疫苗的研制及其临床应用，取得理想的预防效果［1-2］。采用结合多糖(如GAMP-TT)包被酶标反应板，所制备试剂对相应抗体检测的稳定性大幅提高［8］。鉴于相应抗体(尤其是单克隆抗体)的制备与研究同样受多糖自身免疫缺陷的制约［4］，笔者以抗GAMP mAb的研制为契机，对载体结合多糖在单克隆抗体制备中的应用特征进行了探讨。实验结果显示，在相同的实验条件下采用GAMP与GAMP-TT对一组BALB/c小鼠做对比免疫，后者的免疫效果较前者升高超过一个数量级，为采用结合多糖做免疫原制备单克隆抗体提供了选择依据。采用GAMP-TT免疫BALB/c小鼠，经常规融合及筛选，获得一株分泌抗GAMP mAb的杂交瘤细胞(2E7)。采用既往报道的方法制备小鼠腹腔积液，纯化mAb IgG，并对纯化产物进行标记(HRP)，其腹腔积液诱生产量、提取物纯度以及标记抗体的效价等与既往单克隆抗体研究结果大致相同。采用中和及抗原取代酶联免疫吸附法对上述制备物进行考核，初步证实2E7 mAb对GAMP的结合具有良好的特异性。

单克隆抗体技术发端于20世纪70年代中期，其应用已十分普及。然而作为一种大分子弱抗原，细菌荚膜多糖mAb的制备往往需要借助某些新的实验手段［4，8］。采用多糖-蛋白耦联物以矫正并提高多糖的免疫原性是新近研究者所热衷的主要手段之一。然而影响多糖-蛋白偶联物免疫原性的因素至少包括多糖分子大小，载体蛋白的种类，多糖、蛋白耦联度，耦联剂(或称间隔基)的种类，耦联方法及其耦联条件的优化等［4］。笔者采用GAMP-TT耦联物进行免疫，实验动物免疫状态较佳，并获得一株具有较好分泌特征的mAb细胞株。但该细胞株在融合及其早期克隆化过程中的状态并不尽如人意，染色体检测表现出明确的多细胞融合证据。尽管经反复的克隆化与适应性培养而获得了具有稳定增殖与分泌特征的杂交瘤细胞株［9］，但这一现象是否多见于此类特殊制备，即采用结合多糖免疫制备单克隆抗体的方法仍有待进一步实验证实。

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