睡莲花总黄酮超声提取工艺研究

金晓红，耿伟，桂红武

(1.浙江省诸暨市人民医院药剂科，311800;2.新疆医科大学第一附属医院药学部，乌鲁木齐 830054;3.新疆维吾尔自治区人民医院北院，乌鲁木齐 830054)

睡莲花为睡莲科(Nymphaeceae)植物雪白睡莲(Nymphaea candida Presl.)的干燥花，具有清热解毒、镇静安神作用。主要用于小儿急、慢惊风，以及热症引起的头痛、热感、咳嗽。在维吾尔族民间用药历史悠久，是维吾尔医常用的单方或复方抗病毒药中的主要成分［1-2］。笔者研究了睡莲花化学成分，发现其主要化学成分为芦丁、槲皮素、山萘酚、异槲皮苷等黄酮类化合物和小分子酚类物质。黄酮类化合物的生物活性广泛而温和，具有抗菌、消炎、抑制血小板聚集、抗凝及抗血栓形成等作用。笔者在本实验中采用单因素实验及正交实验法考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数对睡莲花总黄酮超声提取效果的影响，以确定其最佳超声提取条件，从而为合理开发利用睡莲花资源提供科学依据［3-4］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 紫外分光光度仪(SHMADZU，UV-2501PC)，电子天平(Sartorliux)，超声提取仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司，AS10200BDT)，真空干燥仪(上海精宏仪器设备有限公司，DZF-6050型)。

1.2 材料 睡莲花(产自新疆阿克苏，提取前先进行晒干、粉碎处理)，芦丁对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号:100080-200306)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的制备 精密称取120℃减压干燥至恒质量的芦丁对照品50.33 mg，置于25 mL量瓶，加入甲醇溶解稀释至刻度，作为储备液。吸取5 mL置50mL量瓶，加入甲醇稀释定容，制成0.201 32 mg·mL-1对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取睡莲花药材5 g，以溶剂提取，将提取液过滤、浓缩、真空干燥(70℃)。精密称取浸膏200 mg，置100 mL量瓶，加入适量甲醇，超声溶解3 min，用甲醇定容，过滤。精密量取续滤液3 mL置50 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，作为供试品溶液，按标准曲线项下的方法测定药材中黄酮含量。

2.3 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液 1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL，分别置 25 mL 量瓶，加入 5% 亚硝酸钠溶液1.0 mL放置6 min，加10%硝酸铝1.0 mL放置6 min，加入4%氢氧化钠10.0 mL，用纯化水稀释至刻度摇匀，放置10 min，在508 nm波长处测定吸光度，以浓度 (X)为横坐标，吸光度 (Y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为:Y=0.437 2X+0.295 3(r=0.999 4)。结果表明，芦丁浓度在 0.201 32 ～1.811 9 mg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

2.4 超声条件下不同因素对黄酮类化合物提取率的影响

2.4.1 乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响 在5 g药材粉末中，分别加入15倍量50%，60%，70%，80%，90%乙醇超声提取15 min，按“2.2”项方法测定药材中总黄酮含量，结果见图1。

由图1可知，随着乙醇浓度的升高，睡莲花总黄酮提取率呈上升趋势，乙醇浓度为70%时提取率最高。但当浓度进一步增加，提取率反而降低。

2.4.2 乙醇用量对黄酮类化合物提取率的影响 在5 g药材粉末中分别加入 70% 乙醇 40，60，80，100，120 mL，超声提取15 min，按“2.2”项方法测定药材中总黄酮含量，结果见图2。

图2 乙醇用量对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol dosage on extraction rate of total flavonids

由图2可知，睡莲花总黄酮提取率随溶剂用量增加而增加，乙醇用量16倍时提取率最高。

2.4.3 超声提取时间对黄酮类化合物提取率的影响

在5 g药材粉末中分别加入15倍量70%乙醇，超声处理10，20，30，40，50 min，按“2.2”项方法测定药材中总黄酮含量。结果见图3。

图3 超声提取时间对药材中总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extaction rate of total flavonoids

从睡莲花总黄酮的提取效果看，随着提取时间从10到60 min，提取开始阶段，总黄酮的提取率随提取时间的延长而增加较快，在30 min时达最高;提取后期提取速度逐渐减慢，提取率呈下降趋势。

2.4.4 超声功率对黄酮类化合物提取率的影响 在5 g药材粉末中加入15倍量70%乙醇，超声功率分别为 30，90，150，210，270 W，超声处理 30 min，按“2.2”项方法测定药材中总黄酮含量。结果见图4。

图4 超声功率对药材中总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic extraction power on extaction rate of total flavonoids

图4表明，在频率、时间和温度固定时，超声波的电功率对维药睡莲花总黄酮的提取率影响不大。

2.4.5 提取次数对黄酮类化合物提取率的影响 在5 g药材粉末中分别加入15倍量70%乙醇，超声处理1，2，3，4，5 次，按“2.2”项方法测定药材中总黄酮含量，结果见图5。

图5 提取次数对药材中总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extraction times on extaction rate of total flavonoids

由图5可以看出，睡莲花中总黄酮的提取率随提取次数的增加而呈上升趋势。

2.4.6 正交实验及其结果 在上述单因素实验的基础上采用正交实验法，以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为4因素，各取3个水平，按照L9(34)正交表进行乙醇超声提取实验，测定睡莲花总黄酮的含量，作为考察指标，并对此进行统计学处理。直观分析结果表明，提取次数对实验的影响最大，其次是乙醇浓度和提取时间，影响最小的是料液比。方差分析结果表明乙醇浓度、超声提取时间、超声提取次数对睡莲花中黄酮的提取影响都很显著，料液比对其影响较小。结合节约成本方面综合考虑，确定超声提取睡莲花中黄酮的最佳工艺是A3B2C2D3，即16倍量的80%乙醇超声提取5次，每次提取30 min。因素水平见表1，正交实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交实验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交实验结果Tab.2 Results of orthogonal test

2.4.7 验证实验 根据筛选得到的最佳工艺(A3B2C2D3)进行验证实验，3份药材样品中总黄酮含量分别为1.42%，1.35%及1.58%。结果表明，提取工艺稳定，重复性良好。

2.5 不同提取方法提取率比较

表3 方差分析表Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

2.5.1 水煎煮法 称取药材粉末5 g，加入16倍水煎煮2次，每次30 min，提取液合并、浓缩、干燥。

2.5.2 回流提取法 称取药材粉末5 g，加入16倍80%乙醇回流提取2次，每次30 min，提取液合并、浓缩、干燥。

2.5.3 超声提取法 称取药材粉末5 g，加入16倍80%乙醇超声提取2次，每次30 min，提取液合并、浓缩、干燥。

2.5.4 结果比较 将上述干燥提取物按“2.2”项方法测定药材中总黄酮的含量。结果水煎煮法药材中总黄酮含量为0.21%，回流提取法为0.44%，超声提取法为1.02%，即超声提取法效果最佳。

3 讨论

笔者在本实验中研究睡莲花总黄酮的提取工艺，单因素及正交实验结果显示乙醇浓度、乙醇用量及超声提取时间对超声提取黄酮类化合物有显著影响，同时确定了提取条件的最佳工艺应为A3B2C2D3，即16倍量的80%乙醇超声提取5次，每次提取30 min。与传统的提取方法比较，发现超声提取法明显优于水煎煮法和回流提取法。水煎煮法和回流提取法需要加热、费时，而超声提取法操作简单、省时，提取效率高。

［1］刘勇民，沙吾提·伊木克.维吾尔药志(上册)［M］.乌鲁木齐:新疆科学技术卫生出版社，1999:119.

［2］中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册［M］.乌鲁木齐:新疆科学技术卫生出版社，1999:111.

［3］王薇，张长弓.葱白总黄酮提取工艺的优化［J］.医药导报，2010，29(3):357－359.

［4］沈继先，林筱琦，王春霞.维药热感颗粒提取工艺研究

［J］.医药导报，2009，28(10):1337－1338.