两例凝血因子Ⅴ缺陷症患者的基因分析

2011-01-21 03:17谢海啸王明山牛真珍谢耀盛
温州医科大学学报 2011年4期
关键词:凝血因子外显子多态性

谢海啸,王明山,牛真珍,谢耀盛

(温州医学院附属第一医院 实验诊断中心,浙江 温州 325000)

凝血因子V(coagulationg factor V,FV)是凝血过程中一种重要的辅因子,其活化形式FVa与Ca2+、磷脂和FXa形成的复合物是体内凝血酶原最主要的激活物。除了凝血功能,FV也通过辅助活化蛋白C下调活化因子VI I I间接参与生理性抗凝旁路途径。FV的这一双重作用,使得FV基因缺陷的临床表现差异较大,可表现为出血、血栓形成,也可无明显临床症状[1]。我们发现了2例凝血因子V缺陷患者,现报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 患者1:女,62岁。白内障术前凝血常规筛查发现血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶(APTT)显著延长,分别为31.5和104.1 s。进一步做凝血因子活性检测,发现FV:C为4%。患者无肝肾功能障碍,无出血病史,父母非近亲结婚。

患者2:女,41岁。眼部翼状胬肉切除术前凝血常规检查发现PT 23.6 s、APTT 75.9 s,FV:C为5%。患者无出血病史,肝肾功能正常,父母亦非近亲婚配。

正常对照组:50例,其中男27例,女23例,平均年龄34(18~60)岁,均为我院健康体检者,经查均无肝肾功能疾病,无血栓或出血史,采样前已征得本人同意。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集和处理:在征得患者知情同意后,采集外周静脉血,0.109 mol/L枸橼酸钠1:9抗凝,立即于3 000 r/min离心10 min后收集上层血浆用于凝血指标检测,2 h内检测完毕。剩余的血细胞-40 ℃冻存,用于DNA提取。

1.2.2 凝血相关指标检测:法国STAGO全自动血凝仪检测APTT、PT、纤维蛋白原(FIB)、FI I:C、 FV:C、FX:C。试剂由STAGO公司配套提供。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

1.2.3 血浆凝血因子V抗原(FV:Ag)检测:采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法。绵羊抗人FV抗体为Cedarlane Laboratories Limited公司产品,辣根过氧化物酶标记的FV抗体的制备使用EZ-Link Plus Activated Peroxidase Kit(Pierce Biotechnology,Inc.公司产品)。血浆样本1:200稀释,酶标记抗体浓度为2μ g/mL,492 nm比色。以50人份正常对照混合血浆为100%,计算患者及家系成员FV:Ag含量。

1.2.4 FV基因测序:按常规酚-氯仿法抽提患者外周血基因组DNA。引物序列参照文献[2]设计并由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR扩增FV的25个外显子序列。PCR反应总体积为50μL,包括10×PCR Bufer,MgCl2(终浓度为 1.5 mmol/L),dNTP(终浓度为200μmol/L),2 U Taq DNA聚合酶,引物(终浓度为0.5μmol/L)。扩增条件:94 ℃,5 min,94 ℃变性30 s,50~60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30~60 s,30~35个循环后,72 ℃,10 min。PCR产物在全自动测序仪上进行测序(美国Applera公司,ABI3730XL型)。

2 结果

2.1 凝血指标检测 患者1 APTT 104.1 s、PT 31.5 s,均明显延长,FV:C为4%,FV:Ag为2.6%。患者2 APTT 75.9 s、PT 23.6 s,亦明显延长,FV:C为5%,FV:Ag为18.9%。见表1。

2.2 FV基因分析 通过Chromas软件将2例患者FV基因测序结果与NCBI基因文库AY364535序列进行比对(Blast)后,再与NCBI中的单核甘酸多态性数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp.ref.cgi?locusId=2153)比对。2例患者共发现了8个基因多态性位点,其中有4个共同的多态性位点均在B区,分别为Lys858Arg、His865Arg、Lys925Glu和Pro1404Ser。具体见表2。

表1 2例FV缺陷患者凝血指标项目检测结果

表2 2例FV缺陷症患者基因分析结果

3 讨论

遗传性凝血因子V缺乏是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病,发病率为百万分之一[3]。FV基因位于人类1q21~25上,由25个外显子和24个内含子组成,长度约80 kb,成熟FV蛋白结构为A1-A2-B-A3-C1-C2,FV在凝血酶或FXa的作用下,在第709、1018和1545位精氨酸处发生裂解,切去其B结构域,活化成为FVa,形成由A1、A2区组成的重链和A3、C1、C2区组成的轻链所构成的异二聚体。FV缺陷症主要分为两型:I型为CRM-,交叉反应物质阴性,即FV抗原(FV:Ag)和活性(FV:C)同步减少;I I型为CRM+,FV:C极低而FV:Ag正常,其产生了无功能或是功能异常的FV蛋白。本研究结果,患者1,FV:C为4%,FV:Ag为2.6%,CRM-。患者2,FV:C为5%,FV:Ag为18.9%,抗原水平稍高,为非典型的CRM-。有趣的是,两人FV:C与FV:Ag水平都很低,诊断为FV缺陷,但皆无明显的临床症状,且除了较多的多态性位点外,目前尚未发现其他突变。

曹丽娟等[4]曾报道两病例具有相同的FV活性和抗原含量,皆为2%,但临床表现却有很大的不同,患者1自出生起出现周期性自发性鼻出血,患者2却一直无症状。FV抗原和活性的含量与临床表现之间没有很好的一致性,目前还没有合理的理论来解释这一点。FV的下降并不是决定FV缺陷患者临床症状轻重的唯一因素。有学者推测可能存在一种未知的调节因子或机制[5]。

本研究2例FV缺陷患者,基因分析未发现其他突变,而只有8个基因多态性位点,国内外文献未报道过类似病例。2例患者同时拥有Lys858Arg、His865Arg、Lys925Glu和Pro1404Ser这4个多态性位点,且均位于B结构域。长期以来,人们对B区的功能不够重视,因为FV活化为FVa时,B区是被切除而游离出来。但凝血酶激活FV的3个位点都位于B区,B区对于FV活化是必要的。Yamazaki等[6]曾报道Met385Thr、His1299Arg、Met1736Val和Asp2194Gly这4种多态性,并对其作了体外表达研究,发现这4种多态性同时存在时,FV的表达水平比野生型显著降低,细胞培养液中FV表达水平仅约为野生型的20%,其原因是变异的蛋白质合成率明显降低且伴分泌障碍,其中Asp2194Gly是造成分泌障碍的关键因素。故推测本研究2例患者B区多态性位点的叠加可能与FV缺陷有关或是某一两个位点起主要作用,具体机制有待进一步研究。

另外患者2 FV:C为5%,FV:Ag为18.9%,抗原水平稍高,为非典型的CRM-,推测其多态性除了导致FV分泌障碍外,还可能有蛋白正常功能的缺失。由于FV基因庞大,基因结构比较复杂,其庞大的内含子区序列突变也可能对其功能产生影响。仅仅通过对外显子区的测序分析,一些FV缺陷症的基因缺陷还是不能被完全确认。因此,对患者的FV基因外显子侧翼含拼接点的内含子进行测序分析是必要的,以期发现新的有意义的突变。

[1] Mannnucci PM,Duga S,Peyvandi F.Recessively inherited coagulation disorders[J].Blood,2004,104(5):1243-1252.

[2] Fu QH,Zhou RF,Liu LG,et al.Identification of three F5 gene mutations associated with inherited coagulation factor V deficiency in two Chinese pedigree[J].Haemophilia,2004,10(3):264-270.

[3] Kalafatis M.Coagulation factor V:a plethora of anticoagulant molecules[J].Curr Opin Hematol,2005,12(2):141-148.

[4] 曹丽娟,王兆钺,苏雁华,等.两例先天性凝血因子V缺乏症基因突变的鉴定[J].血栓与止血学,2007,13(1):17-19.

[5] Wilk R,Nieuwenhuis K,Berq M, et al.Five novel mutations in the gene for human blood coagulation factor V associated with type I factor V deficiency[J].Blood,2001,98(2):358-367.

[6] Yamazaki T, Nicolaes GA, Sorensen KW, et al. Molecular basis of quantitative factor V de?ciency associated with factor V R2 haplotype[J]. Blood,2002,100(7):2515-2521.

猜你喜欢
凝血因子外显子多态性
控制冷沉淀凝血因子在室温下制备时长的临床意义
外显子跳跃模式中组蛋白修饰的组合模式分析
单核苷酸多态性与中医证候相关性研究进展
CLOCK基因rs4580704多态性位点与2型糖尿病和睡眠质量的相关性
外显子组测序助力产前诊断胎儿骨骼发育不良
少见凝血因子缺乏症3例
冷沉淀凝血因子临床应用调查分析
外显子组测序助力产前诊断胎儿骨骼发育不良
蒙古斑在维吾尔族新生儿中分布的多态性
人类组成型和可变外显子的密码子偏性及聚类分析