反式激活蛋白-氧依赖性降解结构融合结构域介导蛋白跨膜转运和氧依赖性降解作用

赵宇，武军华，贾培媛，吴少平，高珊，王晨宇，黄春倩，王玉霞

(1.军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850;2.北京市疾病预防控制中心，北京100031)

反式激活蛋白-氧依赖性降解结构融合结构域介导蛋白跨膜转运和氧依赖性降解作用

赵宇1，武军华1，贾培媛1，吴少平2，高珊2，王晨宇1，黄春倩1，王玉霞1

(1.军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850;2.北京市疾病预防控制中心，北京100031)

目的研究反式激活蛋白(TAT)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运，以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用。方法将TAT，ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合，构建了TAT-ODD-EGFP融合蛋白基因。将该序列克隆到原核表达载体pET28a中，在BL21工程菌中进行表达，通过亲和柱层析法纯化，得到高纯度的融合蛋白。同方法制备EGFP和TAT-EGFP融合蛋白作为对照。在20%O2和1%O2将融合蛋白与A549，H1299和MDA-MB-231细胞系孵育，荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞中的分布以及稳定性。小鼠尾静脉注射不同融合蛋白(10 mg·kg-1)，分别在注射后1，6和12 h处死动物，取脏器在荧光显微镜下观察融合蛋白的分布及稳定性。结果由于EGFP相对分子质量大，无法穿透细胞及组织。TAT可以有效地介导TAT-EGFP进入细胞和动物实体组织，其稳定性不受细胞或组织中氧分压的影响，而TAT-ODD-EGFP进入细胞或组织后，在20%O2条件下迅速降解，但可稳定存在于1%O2细胞及组织中。结论TAT可以有效地转导融合蛋白穿过细胞膜。引入ODD，20%O2下融合蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解，但可以稳定存在于1%O2细胞和组织中，说明TAT-ODD可以转导蛋白进入并靶向存在于低氧的肿瘤组织中。

低氧;依赖性降解结构;TAT;增强型绿色荧光蛋白

蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)是一类具有将外源性生物大分子，如DNA，RNA和蛋白质等转导进入细胞及实体组织内的多肽类物质，主要包括人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的反式激活蛋白(trans-activator，TAT)结构域，单纯疱疹病毒的病毒蛋白22(viral protein 22，VP22)以及果蝇的触角梗节蛋白(antennapedia，Anpt)等［1-2］。PTD介导外源生物大分子发生跨膜转导的机制，之前的理论认为是由于PTD类多肽富含正电荷，与富含负电荷的生物膜发生相互作用，从而介导大分子物质发生内化［3］。而近些年的大量研究表明，PTD的内化过程是由网格蛋白分子介导的细胞内吞作用，同时还伴有细胞膜内脂筏结构的参与［4］。由于PTD可以介导具有活性的生物大分子进入病灶部位，在细胞内发挥其生物功能，因此可以利用其转导生物大分子进入肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。如利用TAT将不同的肿瘤抑制因子如p53，p27和p16等导入实体瘤内部，发挥抑制肿瘤生长的作用［5-7］。但是，PTD的细胞转导作用缺乏靶向性，其融合蛋白对正常细胞可能存在广泛的毒性作用成为限制其应用的关键。

低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是一类具有氧敏感性的转录因子。其结构中含有氧依赖性降解(oxygen-dependent degradation，ODD)结构域，当细胞或组织中氧含量丰富时，ODD结构域可以介导HIF通过pVHL参与的泛素蛋白酶体途径发生降解，使HIF在具有正常氧分压的正常组织和细胞内不稳定，而稳定存在于乏氧区域，如实体瘤的缺氧区域［8］。Harada等［9］首次报道利用ODD结构域最小结构单元与抗肿瘤蛋白胱天蛋白酶融合，在TAT的介导下进入实体组织，特异性地积累于实体瘤的低氧区域，发挥抗肿瘤作用。

为了揭示TAT-ODD介导其融合蛋白进入细胞及组织的普遍规律，本实验以增强绿色荧光蛋白

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

胰蛋白胨和酵母提取物均购自Oxoid公司。PCR扩增引物由英骏公司合成。pET28a-EGFP，pET28a-TAT-EGFP和pET28a-TAT-ODD-EGFP质粒为本室构建。DH5α和BL21(DE3)感受态菌株购自天根生化科技(北京)有限公司。异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)购自Sigma公司，Folin酚和BSA标准品干粉购自Sigma公司，HislinkTMProtein Purification Resin购自Promega公司，小鼠抗His-tag单克隆抗体购自天根生化科技(北京)有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物有限公司，增强型化学超敏发光液(enhanced chemiluminescence，ECL)购自天根生化科技(北京)有限公司。RPMI1640培养基干粉，购自Gibco公司;DMEM培养基及胎牛血清购自Hyclone公司;胰蛋白酶，二甲亚砜(DMSO)，DAPI购自Sigma公司;0.22 μm NC膜购自Poll公司;荧光防促灭封片剂购自普利来生物技术有限公司;GF/C针头式滤器购自Millipore公司;细胞培养板，培养皿购自Costar公司;其他常规生化试剂均为国产分析纯，购自军事医学科学院。

三气细胞培养箱，美国Thermo公司;荧光显微镜，Leica公司;JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机，宁波新芝科仪器研究所;蛋白电泳槽，美国Bio-Rad公司;半干法电转槽，北京六一仪器厂。Varioskan Flash酶标仪美国Thermo公司。

1.2 融合蛋白的制备、纯化及鉴定

1.2.1 细胞培养

人肺腺癌细胞系A549由军事医学科学院基础医学研究所赠送，人非小细胞肺癌细胞系H1299购自协和医科大学肿瘤所，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231为本室保存。A549细胞用含10%FBS，青霉素100 kU·L-1，链霉素100 kU·L-1的DMEM，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养;H1299和MDA-MB-231细胞用含10%FBS，青霉素100 kU·L-1，链霉素100 kU·L-1的PRMI1640，置于(enhanced green fluorescent protein，EGFP)为示踪蛋白，原核表达并纯化了EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP，通过观察该融合蛋白在不同氧分压培养细胞内的稳定性以及其在动物体内不通过组织中的分布特性，探讨TAT-ODD用于靶向抗肿瘤生物大分子药物研究的可行性。37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养。低氧培养时，将细胞放入三气培养箱中，用99.9%的氮气平衡，O2终浓度为1%，低氧培养8 h。

1.2.2 融合蛋白的表达与纯化

将冻存的转化了pET28a-TAT-ODD-EGFP的菌株接种至5 ml LB Kana+培养基中，37℃活化过夜。活化的菌株接种至500 ml 2×YT Kana+培养基中，37℃培养到指数生长期，以IPTG 1 mmol·L-1诱导4h。经4℃，7000×g离心，菌体沉淀于PBS 10 mmol·L-1pH 7.4重悬，超声破碎。超声后的混悬液经4℃，10 000×g离心，含有目的蛋白的上清说明书所述方法，利用梯度咪唑洗脱法经HislinkTMProtein Purification Resin进行亲和层析纯化，收集各洗脱组分，经SDS-PAGE鉴定。将含有纯度较高的目的蛋白的各组分合并，装入截留相对分子质量为30 000的透析袋中，经PEG-20 000浓缩，利用连续梯度透析法，透析至PBS 50 mmol·L-1pH 7.4中。透析后的融合蛋白经改良Lowry等法定量，SDSPAGE和Western印迹法鉴定，过滤分装，于-80℃保存。EGFP和TAT-EGFP同样的方法制备。

1.2.3 Western印迹法鉴定纯化蛋白

蛋白样品经SDS-PAGE分离，利用半干法转印蛋白至NC膜。取出NC膜，用5%脱脂奶粉37℃封闭1 h。加入1∶1000稀释的小鼠抗His-tag单克隆抗体，4℃孵育过夜。用Tris缓冲液-吐温-20溶液(TBST)洗去过量一抗。加入1∶1000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG，37℃孵育30 min。用TBST洗去过量二抗，加入ECL发光液，暗室中曝光。曝光时间视NC膜上信号强弱而定。

1.2.4 细胞荧光染色分析融合蛋白跨膜转运及氧依赖性

将A549，H1299和MDA-MB-231细胞分别以每孔1×105个接种至6孔培养板中，每孔预置一块灭菌处理的盖玻片，规格为20 mm×20 mm，培养过夜。细胞分为4大组，分别加入生理盐水和终浓度为100 mg·L-1的EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODDEGFP，每大组分为2个小组，分别将细胞分别置于常氧(20%)或低氧(1%)氧气浓度条件下培养，1 h后更换新鲜培养基，继续培养1 h。吸去培养基，用预冷的PBS洗去细胞表面残余的培养基，加入预冷的4%多聚甲醛，4℃固定过夜。吸去固定液，用PBS漂洗细胞3次，加入1 ml DAPI 1 mg·L-1染液，室温孵育10 min。吸去染色液，用PBS洗去多余染色液，用抗荧光衰减封片剂封片后在荧光显微镜下观察，拍照。

1.3 在体实验

1.3.1 观察融合蛋白在正常组织内分布

12只雄性BALB/c小鼠，6～8周龄，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK(军)2007-004。按照随机分组分别经尾静脉注射给予生理盐水，EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP融合蛋白10 mg·kg-1。分别在给药后1，6和12 h处死动物，经心脏灌流后取心脏、肝、脾、肺、小肠、肾和脑组织，用干冰冷冻后于-80℃存放。组织进行冰冻切片后直接在显微镜下观察融合蛋白在各组织内的分布并进行拍照。

1.3.2 观察TAT-ODD-EGFP融合蛋白在实体瘤组织内的分布

6只4～6 周龄的雌性BALB/c裸鼠购自维通利华公司，许可证号SCXK(京)2006-0009。

常规培养H1299细胞，生理盐水制成2×1011L-1的细胞悬液。BALB/c裸鼠右侧肩胛皮下接种0.15 ml，接种3只。当肿瘤长至100 mm3左右时，无菌下取出肿瘤，用无菌生理盐水清洗，10 ml生理盐水分散，经200目尼龙网过筛。筛后的细胞悬液按上述方法再接种于正常4～6周龄雌性BALB/c裸鼠皮下。待肿瘤长至200 mm3左右时，剂量ip给予TAT-ODDEGFP 10 mg·kg-1模型对照组给予生理盐水。1 h后处死动物，生理盐水灌流心脏，取肿瘤组织，置于4%甲醛溶液中固定1周，固定后的组织制成石蜡切片，室温存放。组织切片免疫荧光染色步骤参见文献［10］。

2 结果

2.1 3种融合蛋白的表达、纯化及鉴定

将诱导前与诱导后的全菌裂解产物进行SDSPAGE分析(图1)，结果表明EGFP，TAT-EGFP和TATODD-EGFP在菌体中成功表达，凝胶条带定量显示3种融合蛋白含量占菌体总蛋白分别为81%，76%和74%。进一步进行SDS-PAGE分析显示(图2)，3种融合蛋白的可溶性形式在上清中的比例分别为63%，59%和34%。

图1 增强绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白在大肠杆菌BL21中表达.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导4 h后大肠杆菌表达EGFP融合蛋白.M:标志物;泳道1～3:EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP诱导前的菌体全蛋白;泳道4～6:EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP诱导后菌体全蛋白样.TAT:反式激活蛋白;ODD:氧依赖性降解.Fig.1 Expression of enhanced green fluorescent protein(EGFP)fusion proteins in E.coli BL21(DE3).

图2 SDS-PAGE鉴定菌体裂解上清及沉淀中的EGFP融合蛋白.M:标志物;泳道1～3:EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP菌体裂解上清;泳道4～6:EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP菌体裂解沉淀.Fig.2 SDS-PAGE of EGFP in the supernatant and sediment of the sonicated hosts.

SDS-PAGE定量分析经梯度咪唑洗脱后对3种融合蛋白的纯化结果发现，纯化后融合蛋白的纯度分别为91%，99%和96%(图3，图4)，小鼠抗His-Tag标签单克隆抗体对纯化后的融合蛋白进行了鉴定，结果显示纯化的3种融合蛋白均能被小鼠抗His-Tag标签抗体所识别，且相对分子质量正确，说明所得蛋白是目的蛋白(图5)。通过Lowry等法定量的结果显示，0.5 L菌液能得到约15 mg的融合蛋白。

图3 利用Ni亲和柱层析法纯化不同的EGFP融合蛋白.A，B，C分别为EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP经梯度咪唑洗脱后各洗脱组分的SDS-PAGE.M:标志物.A:泳道1～6:咪唑洗脱液20，40，60，80，100和200 mmol·L-1;B:泳道1～9:咪唑洗脱液20，40，60，80，100，200，300，400和500 mmol·L-1.C:泳道1～8:咪唑洗脱液20，40，60，80，300，400，500和1000 mmol·L-1.Fig.3 Purification of different EGFP fusion proteins by Ni-affinity column.

图4 SDS-PAGE分析和鉴定EGFP融合蛋白纯度.M:标志物;泳道1:EGFP;泳道2:TAT-EGFP;泳道3:TAT-ODD-EGFP.Fig.4 Analysis and identification of purified EGFP fusion proteins by SDS-PAGE.

图5 Western印迹法鉴定纯化后的EGFP融合蛋白.泳道1:EGFP;泳道2:TAT-EGFP;泳道3:TAT-ODD-EGFP.Fig.5 Identification of purified EGFP fusion proteins via mouse-anti-His-Tag by Western blotting.

2.2 TAT-ODD-EGFP体外的跨膜转运以及氧依赖稳定性

由图6～图8 A459，H299和MDA-MB-231结果显示，常氧及低氧条件下，3种融合蛋白在对3种肿瘤细胞系的作用结果是一致的。在常氧(图6A～图8A)及低氧(图6B～图8B)条件下，生理盐水组和EGFP组的细胞质(图6～图8，a1，b1)和细胞核(图6～图8，a2，b2)未见绿色荧光;与TAT-EGFP孵育的细胞质(图6c1～图8c1)和细胞核(图6c2～图8c2)中均能观察到明显的绿色荧光，表明TAT可以有效地介导EGFP穿过细胞膜进入细胞内，同时可以使其积累于细胞质和细胞核中。而与TATODD-EGFP孵育的细胞在常氧分压下几乎观察不到绿色荧光(图6Ad1～d3～图8Ad1～d3);在低氧条件下，经相同处理的细胞内可以观察到明显的绿色荧光存在，其强度与TAT-EGFP组的细胞相当(图6B～图8Bd1～d3)。这一结果说明由于引入ODD结构域，TAT-ODD-EGFP在氧分压正常的细胞中迅速降解，而在低氧细胞中稳定存在，使TAT-ODDEGFP融合蛋白的分布具有了低氧靶向性。EGFP，TAT-EGFP，TAT-ODD-EGFP在三种不同的实体瘤细胞内的稳定性结果一致，说明TAT-ODD-EGFP的稳定性依赖于实体瘤的氧分压状态，却不或较少依赖于实体瘤的肿瘤细胞类别。

图6 3种融合蛋白在常氧(20%O2，A)和低氧(1%O2，B)条件下在A549细胞的跨膜能力.A549细胞分别加入生理盐水(a)和终浓度为100 mg·L-1的EGFP(b)，TAT-EGFP(c)和TATODD-EGFP(d)后分别置常氧和低氧条件下培养1 h.1为细胞质，2为细胞核，3为1和2叠加结果.Fig.7 Cell-permeability of different EGFP fusion proteins under normoxia(20%O2，A)and hypoxia(1%O2，B)in A549 cell line.

2.3 TAT-ODD-EGFP融合蛋白在正常小鼠及荷瘤小鼠动物组织中的分布及稳定性

图7 融合蛋白在常氧(A)和低氧(B)条件下在H1299细胞的跨膜能力.分组处理见图6.Fig.7The cell-permeability of different EGFP fusion proteins under normoxia and hypoxia in H1299 cell line.

图8 融合蛋白在常氧(A)和低氧(B)条件下在MDA-MB-231细胞的跨膜能力.分组处理见图6.Fig.8 Cell-permeability of different EGFP fusion proteins under normoxia and hypoxia in MDA-MB-231 cell line.

将三种融合蛋白给予正常小鼠，观察蛋白在小鼠不同组织中的稳定性。图9和图10结果显示，给3种融合蛋白1 h后，给予TAT-EGFP和TAT-ODDEGFP的小鼠各种组织内可以观察到明显的绿色荧光，但是TAT-ODD-EGFP组的荧光强度明显弱于TAT-EGFP组;而在6 h时，只有TAT-EGFP组小鼠组织内可以观察到明显的荧光，TAT-ODD-EGFP组小鼠各组织内的荧光强度明显减弱，几乎观察不到;在12 h时，只有TAT-EGFP组小鼠的各组织内能观察到荧光。而EGFP和生理盐水组的小鼠组织切片在以上3个时间点均观测不到明显的绿色荧光。以上结果说明TAT在体内可以有效地介导融合蛋白进入组织，包括中枢系统，融合蛋白在组织内可以稳定存在，而在ODD存在的情况下，由于融合蛋白在正常组织内可以被迅速降解，TAT-ODD-EGFP不会长时间积累在组织内。图11结果显示，TAT-ODD-EGFP在实体瘤组织内的分布区域与HIF-1α高表达的区域几乎一致，提示TAT-ODD-EGFP可以选择性地分布于实体瘤组织内的低氧区域，这与之前利用TAT-ODD-p53蛋白进行实验时得出的结果是一致的［5］。

图9 EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP在正常小鼠脑(A)、心脏(B)、肺(C)、肝(D)和脾(E)组织中的分布及稳定性.a～d:分别为iv给予生理盐水、EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP.1，2，3分别为药后1，6和12 h.Fig.9 Distribution and stability of different EGFP fusion proteins in the brain(A)，heart(B)，lung(C)，liver(D)and spleen(E)of mice.

图10 EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP在正常小鼠肾(A)和小肠(B)组织中的分布及稳定性.a～d:分别为iv给予生理盐水、EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP.1，2，3分别为药后1，6和12 h.Fig.1 0Distribution and stability of different EGFP fusion proteins in the kidneys(A)and intestine(B)of mice.

图11 TAT-ODD-EGFP在实体瘤组织中与低氧诱导因子1α(HIF-1α)共定位染色.应用H1299细胞系建立的荷瘤模型小鼠，静脉注射TAT-ODD-EGFP后观察蛋白在实体瘤组织分布，同时应用免疫荧光染色方法显示HIF-1α以及TAT-ODD-EGFP在实体瘤组织中的分布.A:TAT-ODD-EGFP;B:HIF-1α;C:细胞核;D:A，B和C叠加.Fig.1 1Colocalization of TAT-ODD-EGFP and hypoxiainducible factor 1α(HIF-1α)in solid tumor tissue.

3 讨论

目前，利用TAT的跨膜转导作用将具有治疗活性的生物大分子导入病灶部位细胞已经成为开发新型生物制剂的研究热点。很多文献报道了利用TAT的透膜转运作用将不同的生物活性分子导入相应模型动物体内进行疾病的治疗，并取得了良好的疗效［11］。曾经利用小鼠黑色素瘤和人非小细胞肺癌动物模型，观察了TAT-p53蛋白的抗肿瘤治疗作用。但是，两次实验结果均没有得到明显的抗肿瘤效果，与体外细胞实验结果不一致［5］。在TAT-p53蛋白中引入ODD结构域后，TAT-ODD-p53在体内外实验中均发挥了较好的抗肿瘤活性。推测是由于TAT转导结构域在体内的跨膜转导作用缺乏靶向性，既可以将与之融合的功能性分子导入病灶组织，也可以将其导入正常组织，由此产生对正常组织的毒性作用，在一定程度上促进肿瘤细胞增长，抵消了它的肿瘤抑制作用。

自从绿色荧光蛋白(GFP)及其改构蛋白EGFP被开发以来，由于其自身具有绿色荧光，容易观察，稳定性好，被广泛地用作报道分子和标记分子应用于实验研究领域［12］。本研究中，构建了TAT-ODDEGFP，与EGFP和TAT-EGFP对照，通过一系列实验初步证明，TAT-EGFP可以广泛并稳定地分布于小鼠的所有实体组织，而TAT-ODD-EGFP在正常组织中不稳定，与TAT-EGFP相比，在注射后6 h在全部正常组织中就很难观察到TAT-ODD-EGFP的存在;这与体外实验以及之前报道的TAT-ODD-p53融合蛋白的生物学特性相似。

在实体瘤组织中，一般认为当瘤体积超过50 mm3时，瘤组织中即存在低氧区域［13］。本实验在荷瘤小鼠瘤体生长至200 mm3时给药进行实验。HIF-1在哺乳动物低氧组织中表达，其稳定性与组织中氧浓度密切相关。通过免疫荧光双染色进行分析显示，TAT-ODD-EGFP的实体瘤组织分布区域与组织中HIF-1α高表达的区域一致。说明TAT-ODDEGFP可以选择性地分布于实体瘤组织中的低氧区域。可见如引入ODD结构域可以通过融合蛋白的氧依赖性代谢，增强TAT转导的低氧靶向性，为实现TAT融合蛋白类药物进行肿瘤治疗提供了新的设计思路。

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Trans membrane delivery and oxygen-dependent degradation mediated
by trans-activator-oxygen-dependent degradation fused motif

ZHAO Yu1，Wu Jun-hua1，JIA Pei-yuan1，WU Shao-ping2，GAO Shan2，WANG Chen-yu1，HUANG Chun-qian1，WANG Yu-xia1
(1.Institute of Toxicology and Pharmacology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China;2.Beijing Center of Disease Prevention and Control，Beijing100031，China)

OBJECTIVETo evaluate trans membrane activity of trans-activator(TAT)protein transduction domain and effect of oxygen-dependent degradation(ODD)domain under different oxygen tension microenvironments in vitro and in vivo.METHODSAn enhanced green fluorescent protein(EGFP)fusion protein conjugate with TAT and ODD was constructed，expressed and purified via a series of molecular biological procedures.EGFP and TAT-EGFP were also prepared following similar manipulation.To assay the cell-permeability and hypoxia-targeting stability in vitro，various tumor cell lines including H1299，A549 and MDA-MB-231 were cultured with different EGFP fusion proteins under 20%and 1%oxygen tension conditions，respectively.The treated cells were fixed and then directly observed by fluorescence microscope.To evaluate the oxygen-dependent stability and the profile of distribution of TAT-ODD-EGFP in vivo，male BALB/c mice were iv given EGFP，TAT-EGFP and TAT-ODD-EGFP 10 mg·kg-1.Animals were executed to harvest organs，including the heart，liver，spleen，lung，kidney，intestine，and brain at 1，6 and 12 h after treatment.The frozen sections were prepared for assay by fluorescence microscope.RESULTSTAT-EGFP could be effectively delivered into and stabilized in the different cell lines in vitro and all tissues of mice were observed in vivo.Like TAT-EGFP，TAT-ODD-EGFP could be transformed into cells by TAT，but its stability was oxygen-dependent because of its degradation property from ODD under different oxygen tensions.CONCLUSIONTAT can deliver its fusion proteins into cells and animal tissues effectively.TAT fusion protein conjugates with ODD was stabilized in hypoxic cells and tissues，but it was degrades quickly in normoxia because of ODD's function.TAT-ODD domain can be used in the targeted transduction of anti-tumor proteins into hypoxic tumor tissues.

hypoxia;oxygen-dependent degradation domain;trans-activator;enhanced green fluorescent protein

The project supported by National Natural Science Foundation of China(30973562);and by the National Basic Research Program of China(2010CB933904)

WANG Yu-xia，E-mail:wangyuxia1962@hotmail.com，Tel:66931645

Q71

A

1000-3002(2011)05-0447-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.007

国家自然科学基金面上项目(30973562);国家重点基础研究发展计划资助(2010CB933904)

赵宇(1983-)，男，博士，主要从事生化药理学研究，Tel:(010)66931645，E-mail:zhaoyu198387@gmail.com;王玉霞(1962-)，女，研究员，博士，主要从事生化药理学研究。

王玉霞，E-mail:wangyuxia1962@hotmail.com，Tel:66931645

2010-10-21接受日期:2011-02-19)

(本文编辑:乔虹)