地塞米松和淀粉样β蛋白片段25－35对PC12细胞损伤和凋亡的影响

李维祖，张文，李侠，尹艳艳，李卫平，3

(1.安徽医科大学药理学教研室，抗炎免疫药理学省部共建教育部重点实验室，国家中医药管理局中药药理三级实验室，安徽合肥230032;2.皖南医学院弋矶山医院药剂科，安徽芜湖230000;3.安庆医药高等专科学校，安徽安庆246003)

地塞米松和淀粉样β蛋白片段25－35对PC12细胞损伤和凋亡的影响

李维祖1，张文2，李侠1，尹艳艳1，李卫平1，3

(1.安徽医科大学药理学教研室，抗炎免疫药理学省部共建教育部重点实验室，国家中医药管理局中药药理三级实验室，安徽合肥230032;2.皖南医学院弋矶山医院药剂科，安徽芜湖230000;3.安庆医药高等专科学校，安徽安庆246003)

目的探讨地塞米松(DEX)和淀粉样β蛋白片段25-35(Aβ25-35)联合作用对PC12细胞损伤和凋亡的影响。方法采用单独或联合应用DEX 0.1～10 μmol·L-1和Aβ25-351～5 μmol·L-1作用PC12细胞24 h，MTT法测定细胞活力;膜联蛋白-Ⅴ，PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率，PI单染流式细胞仪检测细胞凋亡峰;逆转录-PCR检测胱天蛋白酶3 mRNA的表达水平。结果MTT结果显示，与正常对照组相比，DEX 5和10 μmol·L-1，Aβ25-351，5和10 μmol·L-1，DEX 5+Aβ25-351，5和10 μmol·L-1及DEX 10+Aβ25-355，10 μmol·L-1组均可明显降低PC12细胞存活率，而DEX联合Aβ25-35能明显减少PC12细胞数(P＜0.01)。流式细胞仪结果显示，DEX 5 μmol·L-1和Aβ25-351 μmol·L-1单独作用对PC12细胞凋亡率和亚二倍体凋亡峰有一定的增加作用(P＜0.05)，两者联合作用能明显增加PC12细胞早期和中晚期凋亡率，增加亚二倍体凋亡峰(P＜0.01);RT-PCR结果显示，DEX 5 μmol·L-1和Aβ25-351 μmol·L-1单独作用对PC12细胞胱天蛋白酶3 mRNA的表达水平没有明显影响，它们联合作用能明显增加PC12细胞胱天蛋白酶3 mRNA的表达水平(P＜0.05)。结论DEX和Aβ25-35联合作用能明显增加对PC12细胞的损伤，促进胱天蛋白酶3 mRNA表达，诱导PC12细胞凋亡。

地塞米松;淀粉样β蛋白;阿尔茨海默病;细胞凋亡

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是当前引起中、老年人智力降低、痴呆的最常见的神经系统退行性疾病。其病理学特征为淀粉样β蛋白(amyloid beta protein，Aβ)聚集形成的老年斑(senile plaque，SP)，tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)，脑皮质、海马神经元有不同程度的减少等。AD的发病原因还不完全清楚，早在20世纪90年代初就发现AD与下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA)轴功能失调有关。在AD患者中存在HPA轴的功能失调，主要表现为循环中的基础糖皮质激素水平显著升高［1］和地塞米松(dexamethasone，DEX)激发后皮质醇抑制失败等［2］。近年来研究发现，慢性应激和糖皮质激素水平的升高能够影响海马神经元树突的完整性［3-4］，也可以促进海马神经元的死亡［5］。应激水平糖皮质激素能够明显升高转基因痴呆小鼠脑组织匀浆可溶性Aβ1-40和Aβ1-42水平，同时也能够增加不溶性Aβ1-42水平［6-7］。前期研究表明，应激水平的DEX能引起小鼠学习记忆功能下降，对小鼠脑皮质和海马区神经元具有一定的损伤作用［8］。由于糖皮质激素水平和Aβ含量增加对神经元都有毒性作用，而DEX和Aβ联合应用对神经元的损伤作用目前国内外研究较少。为了进一步研究DEX和Aβ联合作用对神经元的影响，本实验观察了在体外DEX和Aβ25-35对PC12细胞损伤及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药品和试剂

PC12细胞株由安徽中医学院李庆林教授惠赠。DEX，Aβ25-35，四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品;DMEM、胰酶-EDTA混合物为美国Gibco公司产品;青霉素(医用粉剂)为哈药集团总厂产品;链霉素(医用粉剂)为华北制药股份有限公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品;膜联蛋白(Annexin)-Ⅴ/PI双染试剂盒和PI单染试剂为凯基生物有限公司产品;Trizol为德国Invitrogen公司产品。焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)为上海索莱宝生物科技有限公司产品;RT试剂盒为TaKaRa大连宝生物公司产品。胱天蛋白酶3和β肌动蛋白引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;DNA标志物DL100为天根生化科技有限公司产品;PCR试剂盒为美国Promega公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

CO2培养箱，香港利康公司;超净工作台，苏州净化公司;倒置生物显微镜，重庆光电公司;FAl004型电子天平，上海天平仪器厂;756MC紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;SpectraMax 190型全波长酶标仪，美国MD公司;TGL-16H高速低温离心机，珠海黑马医学仪器有限公司;PHS-3C精密PH计，上海雷磁创益仪器仪表有限公司;电热恒温水浴锅，上海医疗器械厂;PCR仪，Bio-Rad公司;Biosens SC810凝胶成像系统，上海山富科学仪器有限公司;流式细胞仪EPICSXL，美国库尔特公司;96孔和6孔培养板，美国Costar公司;Winmdi29流式细胞仪分析软件，美国Tonec公司。

1.3 MTT法测定PC12细胞存活

将对数生长期密度为1×108L-1细胞接种于96孔培养板，每孔100 μl，再加100 μl DMEM完全培养基，每组设6个平行复孔。按照分组分别加入含10%血清和双抗的DMEM(正常对照);DEX 0.1，1，5和10 μmol·L-1;Aβ25-351，5和10 μmol·L-1;DEX 5+Aβ25-351，5和10 μmol·L-1;DEX 10+Aβ25-355和10 μmol·L-1。

CO2培养箱中培养过夜，24 h贴壁后，吸出原培养液，用D-Hank液洗2次，换成无血清DMEM培养液孵育24 h，使细胞同步化于G0/G1期。各用药组换含有相应药物的DMEM培养基，对照组换含10%血清的DMEM培养基，观察24 h细胞生长情况，每孔加入20 μl MTT溶液5 g·L-1，37℃孵育4 h后，小心吸弃培养板中的液体，每孔加入150 μl DMSO，振荡10～15 min，使结晶物充分溶解后用酶标仪测定波长490 nm处吸光度(absorbance，A)。细胞存活率按公式:细胞存活率(%)=A实验组/A对照组×100%计算。

1.4 PC12细胞凋亡的检测

1.4.1 细胞分组

将对数生长期密度为3×1011L-1接种于6孔培养板，每孔1 ml，再加1 ml培养基(含10%血清的DMEM完全培养基)，每组设3个平行复孔。按照分组，分别加入加含10%血清和双抗的DMEM(正常对照);DEX 5 μmol·L-1，Aβ25-351 μmol·L-1，DEX 5 μmol·L-1+Aβ25-351 μmol·L-1，CO2培养箱中培养过夜，24 h贴壁后，血清饥饿法，使细胞同步化于G0/G1期。各用药组换含有相应药物的DMEM培养基，正常对照组换含10%血清的DMEM培养基，观察24 h细胞生长情况，拍照，每孔计数3个高倍视野平均细胞数。

1.4.2 膜联蛋白-Ⅴ/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡

取上述分组处理的细胞，用不含EDTA的胰酶消化收集离心，用PBS洗涤细胞2次(111.9×g，5 min)收集3×108细胞，加入500 μl的结合缓冲液悬浮细胞;加入5 μl膜联蛋白Ⅴ-FITC混匀后，加入5 μl PI，混匀;室温、避光、反应5～15 min;用流式细胞仪检测，激发波长488 nm;发射波长530 nm。实验结果采用Winmdi29分析软件进行分析早期和中晚期PC12细胞凋亡率。

1.4.3 PI单染法流式细胞仪检测PC12细胞凋亡峰

取上分组处理的细胞，PI单染流式细胞仪测定细胞凋亡峰，具体步骤如下:用0.25%胰酶消化，收集细胞1×109L-1，111.9×g，离心5 min，弃去培养液。2 ml D-Hank洗涤1次。离心去D-Hank，向试管内加2.5 ml生理盐水，重新悬浮细胞，然后缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇7.5 ml，4℃固定1 h。离心弃去固定液，用D-Hank洗1次，调细胞密度1×106，加1 ml PI重悬混匀。置4℃冰箱，染色20～30 min。离心洗PI染液，加少许PBS液。用流式细胞仪检测:PI用氩离子激发荧光，激发波长488 nm，发射波长630 nm，产生红色荧光，分析PI荧光强度的直方图。用Winmdi29分析软件分析PC12细胞凋亡峰。

1.4.4 逆转录PCR检测胱天蛋白酶3 mRNA的表达水平

取上述分组处理的细胞，Trizol法提取PC12细胞总RNA，紫外分光光度计测定A260/A280值在1.8～2.0之间。取1 μg总RNA于42℃逆转录1 h后，以β肌动蛋白为内参，进行PCR。引物序列及片段长度:β肌动蛋白，上游引物5'-GAGACCTT CAACACCCCAGCG-3'，下游引物5'-TCGGGGCATCGGAAC-CGCTCA-3'，606 bp;胱天蛋白酶3，上游引物5'-AAGCCGAAACTCTTCATC-3'，下游引物5'-TGAGC ATTGACACAATACAC-3'，349 bp。PCR反应条件:95℃预变性2 min;95℃变性40 s，52℃复性40 s，72℃延伸1 min，扩增38个循环;72℃延伸5 min，4℃保存。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，将电泳图像输入凝胶分析系统，进行条带吸光度(absorbance，A)扫描，结果以各目的条带与对应β肌动蛋白的A比值表示。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 DEX和Aβ25－35对PC12细胞存活率的影响

表1结果显示，与正常对照组细胞存活率相比，单独给予DEX 0.1和1 μmol·L-1对细胞存活率无影响;单独给予DEX 5和10 μmol·L-1，Aβ25-351，5和10 μmol·L-1细胞存活率有一定的降低(P＜0.05)，而DEX 5+Aβ25-351，5，10 μmol·L-1，和DEX 10+Aβ25-355，10 μmol·L-1组均可显著降低PC12细胞存活率(P＜0.01)，表明DEX和Aβ25-35联合对PC12细胞具有明显的损伤作用。

表1 地塞米松(DEX)和淀粉样β蛋白片段25－35(Aβ25－35)对PC12细胞存活率的影响Tab.1 Effect of dexamethasone(DEX)and amyloid beta protein fragment 25－35(Aβ25－35)on PC12 cell survival

2.2 DEX和Aβ25－35对PC12细胞形态和细胞数目的影响

图1和表2结果显示，正常对照组PC12细胞贴壁，细胞生长旺盛，很多细胞伸出明显突起，呈三角形或多边形。与正常对照组比较，DEX 5 μmol·L-1和Aβ25-351 μmol·L-1组细胞出现突起减少，细胞数目变少(P＜0.05)。DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1组细胞出现明显的皱缩、变形、细胞突起减少、细胞数目减少等(P＜0.01)。

图1 DEX和Aβ25－35对PC12细胞形态学变化的影响(×400).A:正常对照组;B:DEX 5 μmol·L-1;C:Aβ25-35 1 μmol·L-1;D:DEX 5 μmol·L-1+Aβ25-351 μmol·L-1.Fig.1 Effect of DEX and Aβ25－35on the morphology changes in PC12 cells(×400).

表2 DEX和Aβ25－35对PC12细胞数目的影响Tab.2 Effect of DEX and Aβ25－35on number of PC12 cell

2.3 DEX和Aβ25－35对PC12细胞凋亡的影响

由图2和图3膜联蛋白-Ⅴ/PI双染流式细胞仪检测结果显示，正常对照组PC12细胞早期和中晚期凋亡细胞均较少。与正常对照组比较，DEX 5 μmol·L-1，Aβ25-351 μmol·L-1和DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1均能增加PC12细胞的凋亡率，其中DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1组PC12细胞早期和中晚期凋亡率有明显的增加作用(P＜0.01)。

PI单染流式细胞仪检测结果(图3和表3)显示，正常对照组的凋亡峰较小，与对照组比较，DEX 5 μmol·L-1，Aβ25-351 μmol·L-1和DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1均能增加PC12细胞的凋亡峰，其中DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1对PC12细胞凋亡峰具有明显的增加作用(P＜0.01)。

图2 FITC-膜联蛋白/碘化丙啶(PI)双染检测DEX和Aβ25－35对PC12细胞凋亡率的影响.A:正常对照组;B:DEX 5 μmol·L-1;C:Aβ25-351μmol·L-1;D:DEX 5+Aβ25-35 1 μmol·L-1.Fig.2 Effect of DEX and Aβ25－35on the apoptotic rate in PC12 cells.

图3 PI单染检测DEX和Aβ25－35对PC12细胞凋亡的影响.A:正常对照组;B:DEX 5 μmol·L-1;C:Aβ25-351 μmol·L-1;D:DEX 5 μmol·L-1+Aβ25-351 μmol·L-1.Fig.3 Effect of DEX and Aβ25－35on apoptosis in PC12 cells.

表3 DEX和Aβ25－35对PC12细胞凋亡率的影响Tab.3 Effect of DEX and Aβ25－35on apoptosis in PC12 cells

2.5 DEX和Aβ25－35对PC12细胞胱天蛋白酶3 mRNA表达的影响

RT-PCR分析显示，与正常对照组比较，DEX 5 μmol·L-1和Aβ25-351 μmol·L-1单独作用对胱天蛋白酶3 mRNA表达没有明显影响，DEX 5 μmol·L-1联合Aβ25-351 μmol·L-1对胱天蛋白酶3 mRNA的表达有明显的增加作用(P＜0.05)(图4和表4)。

图4 DEX和Aβ25－35对PC12细胞胱天蛋白酶3 mRNA水平的影响.M:DL100标志物;泳道1:正常对照组;泳道2:DEX 5 μmol·L-1;泳道3:Aβ25-351 μmol·L-1;泳道4:DEX 5+Aβ25-35 1 μmol·L-1.Fig.4 Effect of DEX and Aβ25－35on caspase 3 mRNA level in PC12 cells.

表4 DEX和Aβ25－35对PC12细胞胱天蛋白酶3 mRNA水平的影响Tab.4 Effect of DEX and Aβ25－35on caspase 3 mRNA level in PC12 cells

3 讨论

本研究结果显示，DEX和Aβ25-35单独作用或DEX和Aβ25-35合用均可降低PC12细胞活力;DEX和Aβ25-35单独作用或DEX和Aβ25-35合用均可明显增加PC12细胞的凋亡率。DEX和Aβ25-35单独作用对PC12细胞中胱天蛋白酶3 mRNA表达水平没有明显影响，但两者合用则可明显增加PC12细胞中胱天蛋白酶3 mRNA水平。

大量的研究证实，糖皮质激素水平和Aβ含量的增加对神经元均具有毒性作用［9-10］，AD患者血浆糖皮质激素水平明显高于正常人群［1］，慢性心理应激可以增加AD的发病率［11］。表明糖皮质激素水平的升高和Aβ的毒性作用在AD的发生和发展中都具有重要的作用，可见糖皮质激素和Aβ对AD患者可以产生联合损伤作用。联合作用的主要类型有协同作用、相加作用和拮抗作用等，如果DEX和Aβ的联合损伤作用具有协同或相加作用可能会促进AD的发生和发展，因此研究糖皮质激素和Aβ对神经细胞的是否具有协同或相加损伤作用有重要意义。

本研究结果表明，DEX和Aβ25-35单独作用或联合作用对PC12细胞均有一定的损伤作用。与相同剂量的DEX和Aβ25-35单独作用比较，DEX和Aβ25-35联合作用可以进一步降低PC12细胞活力、增加细胞凋亡率，明显增加PC12细胞中胱天蛋白酶3 mRNA水平，但差异没有显著性。实验结果表明，在体外DEX和Aβ25-35联合作用对PC12细胞可能没有协同损伤作用，DEX和Aβ25-35联合损伤是否具有相加作用还需要进一步的实验来证实。另外由于PC12细胞是来自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞株，关于DEX和Aβ25-35对神经细胞的联合损伤作用及其机制有待于在海马神经元和整体动物上做进一步研究。

［1］Csernansky JG，Dong H，Fagan AM，Wang L，Xiong C，Holtzman DM，et al.Plasma cortisol and progression of dementia in subjects with Alzheimer-type dementia［J］.Am J Psychiatry，2006，163(12):2164-2169.

［2］Näsman B，Olsson T，Viitanen M，Carlström K.A subtle disturbance in the feedback regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in the early phase of Alzheimer's disease［J］.Psychoneuroendocrinology，1995，20(2):211-220.

［3］Kleen JK，Sitomer MT，Killeen PR，Conrad CD.Chronic stress impairs spatial memory and motivation for reward without disrupting motor ability and motivation to explore［J］.Behav Neurosci，2006，120(4):842-851.

［4］Conrad CD，McLaughlin KJ，Harman JS，Foltz C，Wieczorek L，Lightner E，et al.Chronic glucocorticoids increase hippocampal vulnerability to neurotoxicity under conditions that produce CA3 dendritic retraction but fail to impair spatial recognition memory［J］.J Neurosci，2007，27(31):8278-8285.

［5］MacPherson A，Dinkel K，Sapolsky R.Glucocorticoids worsen excitotoxin-induced expression of pro-inflammatory cytokines in hippocampal cultures［J］.Exp Neurol，2005，194(2):376-383.

［6］Green KN，Billings LM，Roozendaal B，McGaugh JL，LaFerla FM.Glucocorticoids increase amyloid-beta and tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease［J］.J Neurosci，2006，26(35):9047-9056.

［7］Dong H，Yuede CM，Yoo HS，Martin MV，Deal C，Mace AG，et al.Corticosterone and related receptor expression are associated with increased beta-amyloid plaques in isolated Tg2576 mice［J］.Neuroscience，2008，155(1):154-163.

［8］Li WZ，Li WP，Yao YY，Zhang W，Yin YY，Wu GC，et al.Glucocorticoids increase impairments in learning and memory due to elevated amyloid precursor protein expression and neuronal apoptosis in 12-month old mice［J］.Eur J Pharmacol，2010，628(1-3):108-115.

［9］Ge YS，Teng WY，Zhang CD.Protective effect of cyclophilin A against Alzheimer's amyloid beta-peptide(25-35)-induced oxidative stress in PC12 cells［J］.Chin Med J(Engl)，2009，122(6):716-724.

［10］Davis KL，Davis BM，Greenwald BS，Mohs RC，Mathé AA，Johns CA，et al.Cortisol and Alzheimer's disease.Ⅰ:Basal studies［J］.Am J Psychiatry，1986，143(3):300-305.

［11］Johansson L，Guo X，Waern M，Ostling S，Gustafson D，Bengtsson C，et al.Midlife psychological stress and risk of dementia:a 35-year longitudinal population study［J］.Brain，2010，133(Pt 8):2217-2224.

Effect of dexamethasone and amyloid beta protein fragment 25－35 on PC12 cells injury and apoptosis

LI Wei-zu1，ZHANG Wen2，LI Xia1，YIN Yan-yan1，LI Wei-ping1，3
(1.Department of Pharmacology，Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immunopharmacology，Ministry of Education，Key Laboratory of Chinese Medicine Research and Development，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Anhui Medical University，Hefei230032，China;2.Department of Pharmacy，Yijishan Hospital，Wannan Medical University，Wuhu241001，China;3.Anqing Medical and Pharmaceutical College，Anqing246003，China)

OBJECTIVETo study the effect of dexamethasone(DEX)and amyloid beta protein fragment 25-35(Aβ25-35)on PC12 cells injury and apoptosis.METHODSDEX 0.1-10 μmol·L-1and Aβ25-351-5 μmol·L-1were administered alone or in combination to PC12 cells.PC12 cells survival was detected by MTT assay.PC12 cells apoptosis was detected by flow cytometer with Annexin-Ⅴ/PI double stain and PI single stain.Caspase 3 m RNA level in PC12 cells was detected by RT-PCR.RESULTSMTT results showed that，DEX 5，10 μmol·L-1，Aβ25-351，5，10 μmol·L-1，DEX 10+Aβ25-351，5，10 μmol·L-1and DEX 5+Aβ25-355 and 10 μmol·L-1could decrease PC12 cells survival after 24 h treatment.While combination of DEX with Aβ25-35could significantly decrease PC12 cells number(P＜0.01).DEX 5 μmol·L-1，Aβ25-351 μmol·L-1could increase the apoptotic rate of PC12 cells.And DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1could significantly increase the apoptotic rate of PC12 cells(P＜0.01).Single DEX 5 or Aβ25-351 μmol·L-1had no significant effect on caspase 3 mRNA levels，but DEX 5 μmol·L-1+Aβ25-351 μmol·L-1could significantly increase caspase 3 mRNA levels.CONCLUSIONCombination of DEX with Aβ25-35can significantly increase the injury and apoptosis in PC12 cells.

dexamethasone;amyloid beta protein;Alzheimer's disease;apoptosis

The project supported by Foundations of Academic Leader of Anhui Province(2005hbz18);the Foundations of Talented Man of Anhui Province(2007Z030);Natural Science Foundations of Education Bureau of Anhui Province(KJ2009A81);and Natural Science Foundations of Education Bureau of Anhui Province(KJ2010B378)

LI Wei-ping，E-mail:lwp19@126.com，Tel:(0551)5161133

R966

A

1000-3002(2011)05-0430-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.004

安徽省高校省学术带头人科学研究资助(2005hbz18);安徽省人才基金(2007Z030);安徽省教育厅自然科学项目(KJ2009A81);安徽省教育厅自然科学项目(KJ2010B378)

作者介绍:李维祖(1971-)，男，副教授，博士，主要从事神经免疫药理学研究;李卫平(1960-)，男，教授，博士生导师，主要从事神经免疫药理学研究。

李卫平，E-mail:lwp19@126.com，Tel:(0551)5161133

(来稿日期:2010-12-06接受日期:2011-07-01)

(本文编辑:乔虹)