86株流感嗜血杆菌分离鉴定及耐药性分析

颜肇扬

(福建省德化县中医院，福建 德化 362500)

86株流感嗜血杆菌分离鉴定及耐药性分析

颜肇扬

(福建省德化县中医院，福建 德化 362500)

目的探讨适合临床实际的流感嗜血杆菌分离鉴定方法，并了解本地区社区获得性下呼吸道感染患者分离的流感嗜血杆菌耐药性。方法常规培养并结合标本直接涂片革兰染色镜检挑选可疑菌落，卫星试验和V+X、V、X因子需求试验进行初步鉴定，法国生物梅里埃公司API NH鉴定板条进行复核鉴定；K-B法药敏，结果判断依据CLSI2010版标准；Nitrocefin法测定β内酰胺酶。结果86份流感嗜血杆菌培养阳性标本直接涂片镜检均为合格标本，并可见大量WBC吞噬和/或伴行革兰阴性小杆菌(形似流感嗜血杆菌)。86株流感嗜血杆菌中产β内酰胺酶17株，产酶率19.8%；对测试的8种药物中，复方新诺明敏感性最低(38.4%)，其次为氨苄西林(73.3%)、阿奇霉素(83.7%)和头孢呋辛(84.9%)，对亚胺培南、阿莫西林/克拉维酸、左旋氧氟沙星和头孢噻肟敏感性较好，均在95%以上。结论实验室人员应重视标本直接涂片镜检，并结合培养提高HIN分离率。HIN对常用抗生素的耐药率应引起临床医师重视，注意合理使用抗菌药物。

流感嗜血杆菌；直接涂片；革兰染色；耐药性；β-内酰胺酶

流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae，HIN)为人类社区获得性呼吸道感染的常见致病菌，主要引起人类中耳炎、肺炎、咽炎、及其他呼吸道感染等疾病[1]。随着抗生素滥用日趋严重，流感嗜血杆菌的耐药性受到普遍关注。本文对本院2007年1月至2011年1月间分离自社区获得性呼吸道感染患者的流感嗜血杆菌及体外药物敏感试验资料进行回顾性分析,以期为临床合理用药提供依据。结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 标本来自我院2007年1月至2011年1月呼吸内科住院48h内患者及门诊患者合格呼吸道标本788份,包括自然咳痰、导管吸痰、支气管纤维镜保护性毛刷刷取物、支气管肺泡灌洗液等。

1.2 试剂 血平板、巧克力平板(含5mg/100ml万古霉素)为本实验室自行配置，培养基半成品购自英国Oxoid公司、HTM药敏专用培养基购自美国BD公司，API NH鉴定板条购自法国生物梅里埃公司，药敏纸片、V+X、V、X因子均购自英国Oxoid公司。

1.3 菌株分离与鉴定

1.3.1 标本接种培养 送检标本立即直接涂片湿片观察细胞种类和数量，依据全国临床检验操作规程第3版判断标准，若合格可接受则接种血平板和巧克力平板，置于35℃，5%CO2培养24h。

1.3.3 标本直接涂片染色镜检 参考文献对所有标本均进行直接涂片革兰染色镜检[2]。取标本脓性部分少许，接种环直接涂抹玻片，自然干燥、火焰固定，镜检。油镜下若见大量形态单一、革兰阴性小杆菌(点状、小杆状)，且与WBC伴行和/或能见吞噬现象(图1)，则可疑为流感嗜血杆菌。

图1 大量WBC，伴行和/或吞噬G阴性小杆菌(箭头所示)，形似流感嗜血杆菌

1.3.2 可疑菌落挑选 挑取血平板上不生长、巧克力平板上生长的透明或半透明、扁平、湿润的露滴状菌落。革兰染色形态及大小与标本直接涂片可疑菌体类似即为可疑菌落。

1.3.3 卫星试验及V、X、X+V因子需求试验，操作按全国临床检验操作规程第3版要求进行。

1.3.4 根据直接涂片染色镜检、菌落形态、卫星试验及因子需求试验等特点进行菌株鉴定。

1.3.5 菌株复核鉴定 采用法国生物梅里埃公司API NH鉴定板条进行，操作按说明进行。

1.4 β-内酰胺酶测定 采用头孢硝噻吩法，操作按照说明书进行。

1.5 体外药敏试验 采用K-B法分别进行阿奇霉素(AZI)、氨苄西林(AMP)、复方新诺明(SXT)、头孢呋辛(CXM)、头孢噻肟(CTX)、亚胺培南(IPM)、左旋氧氟沙星(LEV)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)8种药物的敏感性测定，按CLSI2010版的标准来判定试验结果。

1.6 室内质量控制 选取ATCC49247为质控菌株对上述实验过程进行全程质控。

1.7 统计分析 采用WHONET 5.4版专用统计软件进行。

2 结果

2.1 788份标本中，86份标本HIN培养阳性，阳性率10.9%；包括自然咳痰69份，导管吸痰8份，支气管纤维镜保护性毛刷刷取物5份，支气管肺泡灌洗液4份。

2.2 86例HIN感染患者一般临床资料 86例患者，其中男性59例，女性27例，年龄14～89岁。48例(55.8%)有基础病包括慢性阻塞性肺病、支气管扩张症等，38例(44.2%)为单纯社区获得性肺炎。

2.3 β-内酰胺酶检测 86株流感嗜血杆菌中检出17株β-内酰胺酶阳性，产酶率为19.8%。

2.4 流感嗜血杆菌对8种抗生素体外药物敏感试验结果见表1。

表1 86株流感嗜血杆菌耐药性分布

3 讨论

HIN是社区获得性呼吸道细菌性感染的重要病原菌之一。有研究表明，HIN可以通过纤毛与非纤毛黏附素黏附和侵入到呼吸道上皮细胞，又通过外膜蛋白的改变逃脱中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬,从而在呼吸道长期定植[3]。当患者免疫力下降，尤其是合并有基础病如慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管扩张症等时，HIN可侵犯下呼吸道，导致感染的发生。本组资料中，超过50%的患者合并有上述基础病。

HIN对营养要求高，培养条件苛刻。能否分离到HIN及分离率的高低成为衡量实验室水平的重要标志[4]。对下呼吸道感染者，HIN在国内尤其是综合性医院分离率不高，临床分离株多来自上呼吸道轻症感染者咽拭子标本。迄今为止，对HIN分离培养条件的探索研究日臻成熟，但实际上单纯依赖培养并不能避免漏检和假阳性出现。一方面，由于抗菌药物滥用严重，相当比例的患者在培养前接受过不同种类、疗程不等的抗菌药物经验性治疗 (自行或医嘱)。而经验性治疗的直接后果是导致HIN部分或完全杀灭/抑制，从而漏检，分离率下降；另一方面，实验室人员感性认识积累不够，尤其是对受抗菌药物抑制而未呈现优势生长的情况容易忽略而漏检；第三，随着HIN高选择性培养基的大量使用，使一些上呼吸道标本中定植的HIN很容易被分离而导致假阳性。本组资料对高危人群合格呼吸道标本HIN分离率达10.9%，86份呼吸道标本在接种培养同时均进行直接涂片革兰染色，镜检结果表明，所有标本均为合格可接受(WBC＞25个，SEC＜10个/LP)，均可见大量WBC伴行大量染色、形态单一，细小杆菌或球杆菌，并可见明显吞噬现象(图1)。结合社区获得性下呼吸道感染病原体流行病学资料，不难推断，涂片所见流感嗜血杆菌概率极大。依据涂片结果指引，仔细观察生长情况，有的放矢，可最大限度避免漏检。

长期以来,氨苄西林和阿莫西林是治疗HIN感染的最常用首选药物，上世纪七十年代HIN对氨苄西林耐药首次在欧洲被报道，随后全世界均有这方面的报道。近年来，国内报道该菌对氨苄西林的耐药率也在逐年增加,且不同地区间存在差别[5，6]。本文的结果表明，HIN对复方新诺明敏感性最低(38.4%)，提示该药不宜作为经验治疗选用。其次，HIN对氨苄西林(73.3%)、阿奇霉素(83.7%)和头孢呋辛(84.9%)，而对亚胺培南、阿莫西林/克拉维酸、左旋氧氟沙星和头孢噻肟敏感性较好，均在95%以上，经验应用上述药物治疗HIN感染应具有确切的疗效。HIN对氨苄西林的主要耐药机制是产生β-内酰胺酶,目前研究认为流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶以质粒介导的TEM-1型酶为主，小部分产ROB-1型酶[7]。HINβ-内酰胺酶检测阳性可预测该菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药，氨苄西林的药敏结果可预测阿莫西林的敏感性。本组资料显示细菌对氨苄西林的耐药率达20.9%，产酶率19.8%，提示产β-内酰胺酶是流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药的主要机制。此外，在氨苄西林耐药的HIN菌株中存在一种称为β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药 (β-lactamase-negative and ampicillin resistant，BLNAR)菌株，主要由于青霉素结合蛋白的改变和外膜蛋白通透性的下降而介导耐药性产生[8]。本组资料中，氨苄西林耐药的HIN有一株未检出β内酰胺酶，其具体耐药机制，是否为BLNAR株有待进一步研究。

综上所述，本文认为实验室应重视标本直接涂片工作，结合涂片和培养两方面的信息可有效的最大程度避免HIN漏检和假阳性出现，提高HIN感染的分离率和病原学诊断的准确性。HIN对常用抗生素的耐药率应引起临床医师重视，注意合理使用抗菌药物。

[1]臧焕平,赖国祥.老年人流感嗜血杆菌相关呼吸道疾病研究进展[J].医学综述,2007,13(2):119-121.

[2]孙 敬,陈 会,余理智,等.痰液培养定植菌与病原菌判断方法的探讨.江西医学检验,2006,24(6):458-488.

[3]Kwak YH,Jung HS,Park SE,et al.Serotypes and antimicrobial susceptibility in clinical isolates of Haemophilus influenzae from Korean children in prevaccination era[J].J Korean Med Sci,2000,15(6):616-622.

[4]彭少华,李从荣,李栋等.105株流感嗜血杆菌的分离、鉴定与药敏分析[J].中国人兽共患病杂志,2001,17(4):71-72.

[5]陶云珍,诸丽娟,闵兰芳,等.儿童感染流感嗜血杆菌的耐药性分析[J].中国抗感染化疗杂志,2004,4(6):337-339.

[6]柯永坚,朱红军,肖亮生,等.流感嗜血杆菌耐药性分析[J].实验与检验医学,2010,28(6):575-576.

[7]Gutmann L,Williamson R,Collatz E,et al.Mechanisms of beta-lactam resistance in Haemophilus influenzae[J].Eur J Clin Microbinfect Dis,1988,7(5):610-615.

[8]Sahm DF,Jones ME,Hickey ML,et al.Resistance surveillance of Streptococcus pneumoniae,Haemophilus influenzae and Moraxellacatarrhalis isolated in Asia and Europen,1997-1998[J].J Antimicrob Chemother,2000,45(4):457-466.

R378.4,R446.5,Q939.92

A

1674-1129(2011)04-0379-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.04.018

颜肇扬，男，41岁，主管技师，毕业于福建医科大学医学检验专业，从事医学检验工作，主攻临床微生物学检验。