金黄色葡萄球菌生物膜形成与ica操纵子关系探讨

丁 露，黄小林，陈开森，廖晚珍，胡雪飞，胡妮娅

(1、南昌大学公共卫生学院2007级；2、南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006)

金黄色葡萄球菌生物膜形成与ica操纵子关系探讨

丁 露1，黄小林1，陈开森2，廖晚珍2，胡雪飞2，胡妮娅2

(1、南昌大学公共卫生学院2007级；2、南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006)

目的了解不同部位分离金黄色葡萄球菌在不同时间生物膜形成与ica操纵子关系。方法采用结晶紫法测定不同部位在不同时间形成生物膜的含量；采用PCR法测定菌株是否含有ica基因。结果生物膜形成能力强的菌株则ica基因大部分为阳性。结论含有ica基因的金黄色葡萄球菌则生物膜形成的能力较强。

金黄色葡萄球菌；生物膜；ica操纵子

细菌生物膜是一种重要的毒力因子，在部分病原体的慢性感染中具有重要作用，特别是由于介入手术的开展，导致毒力强的金黄色葡萄球菌(Staphycoccus aureus)容易进入体内，引发潜在的疾病和炎症。金黄色葡萄球菌是临床常见的革兰阳性致病菌，易引起侵袭性疾病，如果形成了生物膜可导致慢性迁延性发展。我们先前的研究证实，不同部位分离的金黄色葡萄球菌在不同时间形成生物膜的能力不同[1]。

实际上，细菌生物膜的形成受到外界因素的影响，同时也受本身基因的调控，有研究证实ica操纵子与葡萄球菌生物膜形成具有重要关系，但也可独立于ica之外的机制。我们对50株不同部位分离的金黄色葡萄球菌进行ica操纵子的检测，以了解本地区ica及与金黄色葡萄球菌形成生物膜的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 金黄色葡萄球菌菌株 共计50株，其中血液、痰液、尿液、创面分泌物和生殖道分泌物各计10株。所有菌株为患者标本且都为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

1.2 MR金黄色葡萄球菌生物膜实验方法 见文献[1]。

1.3 ica-PCR检测是否具有ica基因 TaqDNA聚合酶、dNTPs、5×TBE液为上海生工生物工程有限公司产品，icaADB 基因扩增引物 1：5＇-TTATCAATGCCCAGTTGTC-3＇， 引 物 2：5＇-GTTTAACGCCAGTGCGCTAT-3＇，由上海生工生物工程有限公司合成，ABI5700PCR扩增仪为美国产品，凝胶成像系统为北京君意东方电泳分析仪设备有限公司产品，低溶点琼脂糖为加拿大BBI公司产品。直径为90mm的一次性无菌培养皿购自江苏扬州医疗器械有限公司。

1.4 ica-PCR方法 挑取血平板上2～3个菌落(24h)于2～3ml生理盐水中制成菌悬液，使其浓度为2.5×106CFU/ml左右，按细菌DNA提取试剂盒要求提取DNA。 PCB 反 应 体 系 共 50μl：10× 缓 冲 液 5μl，15mmol／L MgCl 2.5μl，菌液 5μl，dNTPl.5μl，引物各1μl，Taq 酶 0.5U，H2O 30.5μl。循环参数为：93℃预变性 6min；93℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 1min， 循环 35次，最后72℃延伸6min。反应结束后取产物10μl，以2%琼脂糖进行电泳，120V电压下电泳30min后，以凝胶成像系统成像分析。

2 结果

2.1 具有ica操纵子的菌株 血液6株，痰液7株，尿液10株，创面分泌物9株，生殖道分泌物9株。

2.2 不同时间不同部位生物膜形成能力与ica因子关系见表1。

表1 不同时间不同部位生物膜形成能力与ica因子关系

2.3 ica操纵子电泳图谱(624bp)(见图1)。

图1 ica操纵子电泳图谱(624bp)

3 讨论

金黄色葡萄球菌是临床常见的致病菌，在我院2008年细菌耐药监测中占革兰阳性菌的第2位，仅次于表皮葡萄球菌[2]，表明我院金黄色葡萄球菌感染较为严重。另外，我们检测的细菌及进行药物敏感性实验是将细菌建立在浮游状态下，所得结果往往与细菌存在于体内情况不符合，表现为细菌容易形成生物膜。故有必要了解细菌生物膜形成的成因[3，4]。

金黄色葡萄球菌生物膜的形成机制非常复杂，不但与外界因素有关，同时也与细菌本身基因的表达及形成的多种蛋白质参与有关。生物膜的形成包括黏附、聚集、形成、发展和最终形成，任何一个步骤都存在外在因素影响和内部基因的调控[5]。例如，在聚集及生物膜成熟阶段主要是依靠促进细菌相互聚集的多糖黏附素，特别是多糖胞间黏附素(PIA)发挥重要作用。PIA主要由ica操纵子内基因表达的酶进行生物合成，我们的实验共检测了50株分别来自血液、唾液、尿液、创面分泌物以及生殖道分泌物的菌株，并且无论是对哪类标本的检测结果都能证实ica操纵子的表达与生物膜含量具有密切关系(见表1)，即ica操纵子的表达高的菌株随着时间的延长形成生物膜的量增多，也即表现为含ica因子的金黄色葡萄球菌生物膜形成能力随时间的延长而增强，与文献[6]相似。同时我们对不同来源的标本进行了不同时间不同部位生物膜形成能力与ica因子关系比较发现，各组标本检测结果都能证实ica操纵子的表达与生物膜含量具有密切关系(见表1)，其中以尿液组最为明显，可能的原因是尿液感染主要是以革兰阴性菌为主，特别是肠杆菌科细菌为主要的感染细菌，如果尿路出现了金黄色葡萄球菌感染，则表现为宿主的尿路局部免疫能力可能处于一个相对低下的状态。这种情况是否影响到了金黄色葡萄球菌与生物膜形成的有关基因的表达，例如ica操纵子的生物表达，值得深入探讨。另外在早期的感染中创面分泌物分离的ica阳性金黄色葡萄球菌形成的生物膜的能力强于生殖道分泌物分离的标本，而在后期测定中生殖道分泌物分离的MRSA形成生物膜的能力相似于前者，具体原因值得探索[1]。但我们也发现检测出ica因子但生物膜能力有下降情况(见表1)，ica操纵子由紧密相连的icaA、icaD、icaB和icaC四个基因组成，icaA是膜蛋白质，具有N-乙酰葡聚糖转移酶活性，icaB是分泌蛋白质，icaC、icaD是膜蛋白质，这四种蛋白质共同作用合成PIA形成生物膜。但这四个基因受到上游调节基因icaR的作用，且这种作用受到外界因素的影响。例如NaCl可诱导非耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的形成比耐甲氧西林金黄色葡萄球菌要显著，这主要是因为NaCl在非耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中是ica操纵子转录的激活剂，而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生物膜形成主要由葡萄糖诱导产生。在本实验中，我们直接进行了ica操纵子基因检测，由于该基因的表达可存在沉默现象[7]，故我们进行ica操纵子基因检测在少数情况下并不能真实地反应出对应蛋白表达情况。

[1]陈开森,黄小林,丁 露.不同时间段临床分离MRSA生物膜形成能力的探讨[J].实验与检验医学,2011,29(1):37-38.

[2]陈开森,廖晚珍,彭卫华,等.昌大一附院2008年细菌耐药监控[J].实验与检验医学,2009,27(5):481-484.

[3]陈维贤,张莉萍.细菌生物被膜(bacterial biofilm)的研究进展[J].微生物学杂志,2004,1:46-48.

[4]邱瑜蕾,包崇云.生物材料表面细菌生物膜形成与理化特征[J].国际口腔医学杂志,2008,1:76-79.

[5]唐俊妮,周 锐,王红宁,等.葡萄球菌生物膜形成机制与ica之间的关系[J].微生物学通报,2008,8:1287-1291.

[6]Beenken KE,Dunman PM,McAleese F,et al.Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilm[J].J Bacteriol,2008,186(37):4665-4684.

[7]Yarwood JM,Bartels DJ,Volper EM,et al.Quorumsensing in Staphylococcus aureus biofilms[J].J Bacteriol,2004,186(6):1838-1850.

Relationship between formation of Staphylococcus aureus biofilm and ica operon

DING Lu,HUANG Xiaolin,CHEN Kaisen,et al.Grade 2007,School of Public Health of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo understand the relationship between the biofilm formation of Staphylococcus aureus separated from the clinical specimens in different parts or time and ica operon.MethodsThe crystal violet method was performed to determine the content of biofilm formation in different parts or time;PCR method was used to determine whether strains contains ica genes.ResultsThe strains possessing the stronger ability of biofilm formation were tested positive for most of the ica genes.ConclusionBiofilm formation ability is stronger in Staphylococcus aureus containing ica genes.

Staphylococcus aureus；Biofilm；ica operon

R344+.14,R378.1+1

A

1674-1123(2011)04-0353-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.04.007

南昌大学校级课题YF05(2008)

丁露，女，1988年8月出生，现就读于南昌大学公共卫生学院医学检验专业。

陈开森，1975年出生，男，汉族，江西省武宁人，医学硕士。主要研究方向：细菌耐药机制。