弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与PCR-SSCP分析

胡秀彩,王 艺,吕爱军

(徐州师范大学生命科学学院,江苏徐州 221116)

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是中国主要食用经济鱼类之一。近年来草鱼养殖规模和产量快速发展,同时细菌性病原感染给草鱼养殖业带来了巨大的经济损失[1]。随着河流、海洋环境的污染,人畜共患病原菌开始感染鱼类,已报道从鱼类等水生动物中分离到气单胞菌(Aerom onas)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、假单胞菌(Pseudom onas)等多种人畜共患病原菌[2-5]。最近Akoachere等[6]从沿海鱼类的肠道、鳃等组织中分离到大肠埃希菌(Escherichiacoli)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter fruendii)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)等人类致病菌,证实对氨苄青霉素耐药率达45.7%。弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)是一种“人-兽-鱼”共患病病原菌,可引起人、哺乳动物、鱼、鳖、虾等感染发病[7-11]。目前关于鱼类肠道中弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定研究,国内外鲜有报道[4]。本研究以草鱼为实验对象,从其肠道中分离到3株弗氏柠檬酸杆菌,并进行形态学观察、生理生化特征、药敏试验、动物试验、构建系统发育进化树及PCR-单链构象多态性分析(PCR-single strand conformation polymorphism,SSCP),为鱼类疾病诊断防治提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 草鱼购自徐州市某菜市场,随机选取体重约500 g左右的草鱼用于细菌分离;斑马鱼(平均体重约0.25 g)购自徐州市某花鸟市场;小鼠(平均体重22 g)购自徐州医学院实验动物中心。

1.1.2 培养基 麦康凯琼脂(MaC)、伊红美蓝琼脂(EMB)、三糖铁琼脂(TSI)培养基、常规细菌微量生化鉴定管、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ-15e、药敏纸片等购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.3 主要试剂 革兰阴性菌基因组提取试剂盒、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP等购自上海捷瑞生物工程公司,pMD18-T Vector试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离、形态观察与生化试验 无菌操作取草鱼中后部肠道,用无菌生理盐水冲洗3次,刮取鱼肠内容物,加无菌生理盐水于离心管中混匀后300 r/min离心5 min,吸取适量上清液涂布普通营养琼脂、MaC平板,29℃培养24 h,挑取菌落形态特征不同的单个菌落进行分离纯化,获得纯种转接试管斜面培养基上保存、备用。获得菌株经革兰染色,在光学显微镜下观察;同时挑取单菌落,用4%的戊二醛固定1 h,PBS洗3次,再用4%的戊二醛固定30 min,PBS洗3次,乙醇梯度脱水,最后加叔丁醇脱水,在H ITACH I S-3400N扫描电子显微镜下观察细菌形态特征。取纯培养菌,分别划线接种于普通营养琼脂、MaC、EMB、TSI培养基平板,29℃培养24 h,分别检查生长情况及菌落特征。细菌微量生化鉴定参照文献[12]方法进行,并连续观察7 d。

1.2.2 细菌总DNA提取、16S r DNA基因的PCR扩增及系统发育树分析 采用革兰阴性菌基因组提取试剂盒提取细菌总DNA,经琼脂糖凝胶电泳检测后,将3株菌的总DNA于-20℃保存备用。以总DNA为模板,采用细菌通用引物进行16S rDNA基因扩增,正向引物:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′,反向引物:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。10μL反应体系分别包括:5 U/μL的TaqDNA聚合酶0.1μL,10×buffer 1μL,25 mmol/L的MgCl20.6μL,2.5 mmol/L的dNTP混合物0.2μL,引物各0.3μL,模板DNA 0.4 μL,无菌双蒸水7.1μL。PCR反应条件:94℃预变性4 min、94℃变性30 s、57℃复性30 s、72℃延伸1 min,30个循环后72℃延伸10 min。PCR产物连接pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α筛选阳性克隆,送上海生工生物工程有限公司测序。将3株菌的16S rDNA基因序列通过NCB I的Blast检索系统(http://www.1ncbi1nlm1nih1gov/Blast/)进行序列同源性分析,使用ClustalX1.8软件与从GenBank数据库中获得的细菌16S r DNA基因序列进行多序列匹配排列(Multiple Alignments),采用邻接法(Neighbor joiningmethod)构建系统发育树,并通过1 000次的自举分析(boost rap)进行置信度检测。

1.2.3 16S r DNA基因V3区的PCR-SSCP分析

以总DNA为模板,正向引物:5′-CAGTCACGACGTTGTAA-3′,反向引物5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。10μL反应体系包括:5 U/μL的TaqDNA聚合酶0.1μL,10×buffer 1μL,25 mmol/L的MgCl20.6μL,2.5 mmol/L的dNTP混合物0.2μL,引物各0.3μL,模板DNA 0.4μL,无菌双蒸水7.1μL。PCR反应条件:94℃预变性4 min、94℃变性30 s、51℃复性30 s、72℃延伸1 min,30个循环后72℃延伸10 min。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。SSCP分析参考文献[13]进行。简述如下:取6μL的PCR产物,与4μL变性缓冲液混匀,98℃变性10 min后立即冰浴10 min,于10%PAGE中电泳,4℃、180 V电泳2.5 h(Bio-Rad);电泳后先用蒸馏水洗1～2次,0.1%AgNO3染色15 min,然后利用2.0%NaOH(0.2%甲醛)显色,直至条带清晰为止;照像并分析SSCP带型。

1.2.4 动物试验与药敏试验 小鼠试验以3株菌29℃培养24 h,制备终浓度为9×108cfu/mL的菌液,小鼠腹腔注射0.2 mL,每株细菌注射3只,观察7 d,记录结果。死亡的小鼠无菌操作取脏器接种营养琼脂平板上,观察有无相应的细菌生长。对照组注射无菌生理盐水,剂量相同;斑马鱼感染实验分为饲养温度25、28℃2组,采用菌浓度为108cfu/mL的TC-2菌株进行浸泡感染试验,浸泡时间为10 min,每组5条斑马鱼,连续观察7 d,实验重复3次,统计致死率,对照组用等量0.65%氯化钠溶液同样处理。药敏试验采用纸片扩散法,无菌操作将药敏纸片分别置于含菌LB琼脂平板上,每种药3个重复,根据药敏试验判断标准,确定病原菌对不同药物的敏感程度。

2 结果与分析

2.1 菌体形态及培养特征

3株菌均为革兰阴性杆菌、无芽胞、大小约为(0.5～1.0)μm×(1.0～2.5)μm,在普通光学显微镜下多呈分散或成对排列,在扫描电镜观察3株菌菌体呈杆状(有的菌体稍弯曲)、2端钝圆(图1)。3株分离菌在营养琼脂平板上菌落呈圆形光滑、湿润、隆起、半透明、乳白色、边缘整齐,直径多在1.5 mm;在MaC平板上培养24 h后形成圆形光滑、边缘整齐、稍隆起的菌落,直径多在2.0 mm左右,TC-1菌株菌落呈红色,TC-2菌株菌落呈白色,TC-3菌株菌落呈白色中间带红点;在EMB平板上培养24 h后形成圆形光滑、边缘整齐、稍隆起的菌落,TC-1菌株直径多在1.5 mm,菌落呈紫黑色,TC-2菌株直径多在1.5 mm,菌落呈灰黑色,TC-3菌株直径多在1.0 mm,菌落呈灰白色;在TSI平板上培养24 h后形成圆形光滑、边缘整齐、稍隆起的黄色菌落,直径多在3.0 mm;TC-1、TC-3菌株在TSI琼脂高层斜面下部呈黑色、斜面呈黄色,TC-2菌株在TSI琼脂高层斜面下部呈黑色、斜面呈红色。

2.2 生化特征

3株菌生化特性结果见表1,查阅《伯杰氏系统细菌学手册》[14],结果表明菌株TC-1、TC-2及TC-3的形态学特征和各项生理生化检测结果基本符合柠檬酸杆菌属的特性,初步确定为柠檬酸杆菌属(Citrobacter);进一步查询肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌生化数值编码表,3株菌株鉴定均为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter fruendii)。

图1 3株分离菌的扫描电镜照片(标尺=0.5μm)Fig.1 Scanning electron micrograph of the three isolated strains(bar=0.5μm)

2.3 菌株16S rDNA序列、PCR-SSCP和系统发育学分析

分离菌株TC-1、TC-2和TC-3 PCR扩增的16S rDNA序列长度为1 505 bp,在GenBank中登录号为HQ399663。将3个分离菌株的16S rDNA基因序列通过NCB I的Blast软件进行序列同源性检索,结果其与柠檬酸杆菌属(Citrobacter)等肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌的16S r DNA基因序列自然聚类,在检索出的弗氏柠檬酸杆菌等细菌序列中,3个分离菌株与弗氏柠檬酸杆菌DS M 30039模式株同源性分别为99.59%、99.47%和99.53%,与其他菌株的同源性在96%～99%,TC-1、TC-2和TC-3均为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),这与3菌株的生化表型鉴定结果一致。以弗氏柠檬酸杆菌(AJ233408)16S rDNA基因为参照序列,对3株分离细菌16S rDNA基因高变区V3区序列比对,Blast搜索发现5个SNP突变位点,即449C→T,461T→C,469G→A,471G→A,479C→T;进一步采用PCR-SSCP分析表明,菌株TC-1、TC-2和TC-3的16S rDNA V3区呈现基因多态性,具有不同的SSCP指纹图谱,其中TC-1菌株与TC-2、TC-3菌株SSCP带型明显不同,菌株TC-2、TC-3之间的SSCP带型有微弱差异,结果表明弗氏柠檬酸杆菌SSCP图谱中菌株之间带型存在一定差异(图2),这与16S rDNA V3序列分析结果一致。在GenBank中选取了其中16株细菌的16S rDNA基因序列进行系统发育学分析,结果显示3个分离菌株基本属于同一个分支类群中,其中TC-1菌株与TC-2、TC-3菌株亲缘关系较远,TC-2与TC-3菌株亲缘较近,系统发育树见图3。

表1 3株分离细菌的生化特征Table 1 Biochemical characteristics of the three isolated strains

图2 3株菌16S rDNA V3区的PCR-SSCP分析Fig.2 PCR-SSCP analysis of the 16S rDNA V3 region of 3 strains

2.4 动物试验

对3株分离菌株分别进行动物感染实验,结果发现仅有TC-2菌株对小鼠、斑马鱼有致死性。小鼠在注射24～36 h后全部死亡,死亡率为100%,感染发病死亡的小鼠肠道黏膜淤血、出血明显。将TC-2株对斑马鱼浸泡感染试验,结果表明当饲养温度为25℃时,24～96 h致死率为66.7%;当饲养温度升为28℃时,致死率为86.7%。感染发病死亡的斑马鱼呈现皮肤、腮部出血,腹部膨胀等症状。

2.5 药敏试验

用9类18种药物对3株菌株进行药物敏感性测试,结果表明对头孢噻肟、头孢曲松、洛美沙星、诺氟沙星等多种药物敏感,见表2。

图3 3株菌16S rDNA基因序列构建的N J树(▲代表分离株)Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences of 3 strains(▲indicates the isolates)

表2 药敏试验结果Table 2 Results of drug sensitivity test

3 讨 论

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)为肠杆菌科、柠檬酸杆菌属的成员,在土壤、水体、污水、食物中广泛分布,此外在哺乳动物、鸟类、爬行动物和两栖动物等体内也可分离得到,一般认为弗氏柠檬酸杆菌是原发性或继发性感染的病原菌[14]。近年来,关于弗氏柠檬酸杆菌导致鱼类感染疾病的报道不断增加[15-16]。Sato等[17]最早从水族箱养殖的翻车鲀(M ola m ola)分离到弗氏柠檬酸杆菌,感染发病表现皮肤腐烂、出血、肠炎等症状。Toranzo等[18]报道鱼源弗氏柠檬酸杆菌不能导致小鼠感染发病。Svetlana等[2]报道弗氏柠檬酸杆菌可引起虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肠炎,导致较高的死亡率。舒新华等[19]报道弗氏柠檬酸杆菌感染乌鳢(Ophiocephalus argus Cantor)导致腹水病。陈翠珍等[20]研究表明弗氏柠檬酸杆菌引起中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis H.Milne-Edwards)感染。本研究从草鱼肠道中分离获得3株弗氏柠檬酸杆菌,其中TC-2菌株对斑马鱼有致病性,感染引起斑马鱼(Danio rerio)皮肤、腮部出血,腹部膨胀等症状,并且感染与水温有关。因此推测TC-2菌株疑似为草鱼肠道中的条件致病菌,有可能由水中进入草鱼肠道后再大量增殖,在水温等环境条件改变时从而导致草鱼感染发病。

陈翠珍等[20]对引起中华绒螯蟹死亡的3株弗氏柠檬酸杆菌进行药敏试验,结果显示均对头孢噻肟、头孢曲松、诺氟沙星、氧氟沙星等药物敏感;对利福平、头孢唑啉、新生霉素等耐药。林启存等[21]对引起中华鳖(Pelodiscus sinensis)败血症的弗氏柠檬酸杆菌进行药敏试验,结果表明对复方新诺明、四环素耐药,而对庆大霉素、丁胺卡那等药物敏感。Nawaz等[4]对鲶鱼(Ictalurus punctatus)肠道中柠檬酸杆菌药敏试验结果显示对利福平、红霉素等耐药。本实验对3株弗氏柠檬酸杆菌进行药敏试验,获得结果与以上报道基本一致,但对环丙沙星、庆大霉素、红霉素等药物敏感性存在明显差异,这可能与临床用药导致耐药菌株不同有关。以上结果为临床治疗鱼病合理选择抗生素或减少抗生素滥用提供一定科学参考。

王永等[22]对常见食源性致泻大肠埃希菌(D iarrheogenic Escherichiacoli)、沙门菌(Salm onellae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)进行SSCP分析,结果表明4种致病菌16S r DNA单链构象多态性具有种属特异性。罗雯等[23]通过PCR-SSCP等分子技术快速鉴别了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(V ibrio parahem olyticus)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、铜绿假单胞菌(Pseudom onas aeruginosa)等10种常见病原菌。Schwieger等[24]研究表明PCR-SSCP方法可以应用于植物土壤微生物与根际微生物群落分析。Nair等[25]报道沙门菌(Salm onella)不同的血清型呈现不同的SSCP图谱。最近,Takahashi等[26]将PCR-SSCP技术成功用于鱼类细菌的检测和鉴定。本实验结果表明,3株弗氏柠檬酸杆菌的SSCP图谱在条带数目、相对迁移率及条带间距方面,相互间均存在明显差异,且其差异似与亲缘关系成正比,即亲缘关系越远,差异越明显,这与16S rDNA V3区序列多态性分析结果基本一致。SSCP是近年来发展起来的一种简便、快速的基因突变分析技术,在动物肠道细菌鉴定中应用较多,目前在鱼类中报道较少[26]。本研究表明弗氏柠檬酸杆菌16S r DNA V3区的PCR-SSCP图谱具有很好的菌株鉴别效果,因此在鱼类病原菌诊断中值得推广应用。

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