黑棘鲷胚胎发育过程及特殊结构观察

官曙光, 刘洪军, 李祥东, 于道德

(1. 山东省海水养殖研究所, 山东 青岛266002; 2. 烟台百佳水产有限公司 山东 烟台 265715)

黑棘鲷胚胎发育过程及特殊结构观察

官曙光1, 刘洪军1, 李祥东2, 于道德1

(1. 山东省海水养殖研究所, 山东 青岛266002; 2. 烟台百佳水产有限公司 山东 烟台 265715)

驯化野生黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii)作为亲鱼, 自然受精, 通过溢水法收集发育同步的受精卵。受精卵孵化条件为水温(21.0±0.5)℃, 盐度32～33, pH7.8～8.2, 微充气。在奥林巴斯SZ61解剖镜下对黑棘鲷的胚胎发育进行观察, 并使用CCD图像传感器拍照, 描述了各发育时期的发育时序和形态特征。黑棘鲷受精卵为圆球形端黄卵, 单油球, 卵膜薄、局部具龟裂结构, 卵子直径0.84～0.98 mm,n=30, 卵黄均匀透明。其胚胎发育可分为胚盘形成期、卵裂期、桑椹期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官发生期、尾芽期、肌肉效应期。在水温(21.0±0.5)℃, 盐度32～33的条件下, 受精卵历时32 h完成孵化。在黑棘鲷胚胎发育过程中, 发现部分卵子具两个油球, 卵黄囊膜较脆弱, 心脏附近具有类似于柯氏囊的囊泡存在。另外, 高温(25℃)在大大缩短孵化时间的同时, 增加了胚胎的畸形率和死亡率。

黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii); 胚胎发育; 柯氏囊

黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii(Bleeker, 1854)),隶属鲈形目(Perciformes)、鲷科(Sparidae)、棘鲷属(Acanthopagrus)[1], 而中国海水养殖中最常见的鲷科鱼类, 真鲷(Pagrus major)属于赤鲷属(Pagrus)。黑棘鲷的俗称鲡、黑加吉、乌格鱼、海鲋等。为暖温性底层鱼类, 喜栖息于砂泥底质或多岩礁的浅海, 分布于俄罗斯、中国、朝鲜半岛及日本沿海。黑棘鲷具有生长迅速、食性较杂、适应能力和抗病力强等特点, 且肉质鲜美、营养丰富, 深受人们喜爱。自20世纪 80年代以来,随着黑棘鲷人工繁殖技术的突破和苗种培育试验的成功, 在中国沿海及咸淡水地区, 黑棘鲷的池塘养殖和网箱养殖取得了迅猛发展,成为中国重要的海水养殖品种之一[2]。但是黑棘鲷养成周期长, 抗病力差。为了黑棘鲷养殖业的稳定与持续发展, 由宁波市海洋与渔业研究院开展了真鲷与黑棘鲷的杂交工作[3]。目前, 黑棘鲷主要是作为增殖放流品种而进行人工培育, 而对其胚胎发育过程及特殊结构观察的研究并不多见。

作者对黑棘鲷的早期发育和特殊结构进行了详细观察, 取得了其早期发育大量的生物学资料, 为进一步开展黑棘鲷的生物学研究以及增养殖提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 亲鱼来源

黑棘鲷亲鱼为山东省龙口市烟台百佳水产有限公司自养, 数量 30尾, 雌雄各半。威海周边海域捕捞的2～3龄野生黑棘鲷, 通过自制亲鱼饵料进行营养强化和人工生殖调控促性腺发育, 培育成熟, 自然产卵。

1.2 受精卵及孵化条件

每天晚上 16:00～17:00为亲鱼的产卵高峰期,停气通过溢水法用网袋收集受精卵, 利用孵化网箱放入恒温水池进行孵化, 受精卵孵化条件为水温(21.0±0.5)℃, 盐度 32～33, pH 7.8～8.2, 微充气; 初孵仔鱼的培育水温为(22.0±0.5)℃, 随仔鱼发育缓慢升高至23～24℃, 保持此温度进行培育。

1.3 观察方法

孵化期间定期取样, 记录孵化水温。使用Nikon YS100型显微镜和奥林巴斯SZ61解剖镜观察胚胎发育, 记录发育各时期的形态特征; 使用 CCD图像传感器和SONY H-50相机拍照; 使用DN-2显微图像处理软件, 结合目微尺、台微尺测定卵径, 每次观察胚胎3组, 每组至少30粒左右。发育时间的确定按照受精卵50%以上达到该时期界定。

2 结果

观察结果显示, 黑棘鲷卵属端黄卵, 为单油球的悬浮卵, 呈圆球形、分离透明。卵膜局部具龟裂结构, 卵黄均匀无色。卵径平均为0.84～0.95 mm。黑棘鲷受精卵行盘状卵裂。在水温(21.0±0.5)℃, 盐度33的条件下, 受精后 40 min形成胚盘, 受精后 1 h开始第一次卵裂, 卵裂期共历时5 h 30 min。这段时期最显著的特点就是胚盘的形成带动卵黄囊向上同样形成一个尖状突起。受精后7 h 20 min胚盘细胞开始下包并内卷, 胚胎发育进入原肠胚阶段, 此阶段是胚体发育中变化最剧烈的时期, 在出现胚体雏形的同时形成神经板, 头部形成眼泡。原口关闭前, 柯氏囊出现(Kupffer’s vesicle, KV), 色素开始形成, 体节6~8对。原口关闭后, 胚胎进入器官形成期, 听囊、嗅囊、晶体等依次形成。受精后22 h10 min, 胚体尾芽形成并开始脱离卵黄囊, 受精后23 h20 min胚胎开始出现微弱心跳; 随着胚体进一步发育, 心跳加快, 并伴随着肌体的间歇颤动。在受精后32 h, 心率达到60次/min左右, 胚体发育进入到最后的孵化时期, 仔鱼主要以头部首先破膜的方式孵化。其具体的发育时序及发育特征见表1及图1。

表1 黑棘鲷的发育时序及发育特征Tab. 1 Developmental stages and characteristics of Sparus macrocephlus embryo

图1 黑棘鲷的胚胎发育(×32)Fig.1 Embryonic development of Acanthopagrus schlegelii(×32)

3 讨论

与大部分海洋真骨鱼类类似, 黑棘鲷的受精卵也是端黄卵, 行盘状卵裂。而且前期大部分过程: 包括细胞分裂期、桑椹期、高囊胚、低囊胚以及原口闭合前, 与其他鱼类尤其是鲷科的真鲷胚胎发育并无差异。在进行海洋鱼卵仔鱼调查的过程中, 此时用于区分不同鱼类卵子的主要特征就依赖于卵径。当胚胎继续发育, 尤其是色素出现后, 开始具有种属的特异性, 黑棘鲷的胚胎发育色素出现在原口关闭后, 最终孵化仔鱼的尾部 6体节出的色素带成为该种类典型的仔鱼特征。

3.1 卵黄囊膜

鱼类的卵子具有二层膜结构, 外一层为卵膜,内层为卵黄囊膜。在对胚胎进行拍照的过程中, 利用解剖针拨动受精卵, 由于卵膜受到压力变形, 松开解剖针后, 卵膜恢复弹性, 而部分胚胎的卵黄囊膜会出现破裂(图 1-26)。作者在进行其他海水鱼类(真鲷、牙鲆等)的胚胎发育观察过程中, 从未发现如此脆弱的卵黄囊膜。这种脆性是否也与黑棘鲷第一次繁殖相关, 尚不清楚。

3.2 油球(oil globule, oil droplets)与龟裂结构

海洋鱼类的卵子, 根据物理性质有几种分类方法: 黏性和非黏性, 浮性和沉性等。其中根据油球的有无可以分为3种类型: 单油球浮性卵(60%)、无油球浮性卵(25%)和多油球浮性卵(15%)[4]。一般来说,油球的有无与卵子的浮性相关, 因为油球的本质为脂肪, 比重轻于海水, 因此具有油球的卵子一般都是浮性卵[4-5]。实际上, 即使是无油球的卵子也可以在 32%~34%下呈现漂浮状态, 例如条斑星鲽[6], 这是因为这种卵子在最后成熟阶段水化过程, 吸入大量比重同样轻于海水的水(体积增加3~6倍)[7], 而呈现上浮特性, 只是不如油球的明显[8-9]。本实验观察了 3批自然受精卵, 其中只有第一批受精卵具有双油球, 占 15%~20%(图 1-25), 由于第二个油球很小,因此应该也属于单油球类型。作者在以前进行真鲷胚胎观察的过程中, 发现过类似现象, 而且其同批次的卵子中含第2个油球的比率很高(60%~80%), 据中国科学院海洋研究所李军教授介绍是由于产卵的真鲷过于老龄化所致(当年的真鲷为13龄, 2007年)。本实验所用亲本为二三龄鱼, 不存在老龄化问题,可能是第一次繁殖产卵的缘故。因此笔者推断部分亲本应该属于第一次进入繁殖期, 具有卵质量不稳定、出现2个油球的可能。另外, 具蒋宏雷等[3]报道的黑棘鲷卵子表面并无龟裂结构, 作者也曾观察过真鲷的卵子和胚胎发育过程也无此结构出现。本实验发现的龟裂结构(图1-23, 图1-28)可能是由于第一次繁殖所致。

3.3 关于柯氏囊

Kupffer[10]在 1868年发现真骨鱼类胚胎发育过程中会出现一个囊泡。此后为纪念这个鱼类学家, 以其名命名这个器官, 即为柯氏囊(Kupffer’s vesicle)。而关于柯氏囊的作用一直是个谜, 也成为鱼类胚胎学家最感兴趣的话题。近年来研究证实了柯氏囊启动了鱼类的不对称发育[11]。不对称发育现象普遍存在于脊椎动物, 例如人类身体左侧的胃、心脏和脾脏;右侧的肝脏就是典型的不对称发育器官。

柯氏囊是一个内含单纤毛细胞(monociliated cells)的器官[12]。这些单纤毛细胞在柯氏囊的背腹部不对称分布, 导致内液进行逆时针流动, 正是这种流动起始了胚胎发育的不对称性[11,13]。作者虽然没有对柯氏囊进行深入的研究, 但是在进行胚胎观察的过程中, 发现有的胚胎在心脏原基的部位也会出现一个或几个类似于柯氏囊的泡状囊泡(图1-27), 由于鱼类的心脏是属于发生上出现的第一个不对称器官, 这种囊泡的存在是否也与柯氏囊的作用类似,还需要进一步深入研究和探讨。

3.4 高温的致死和致畸作用

类似于其他真骨鱼类, 在一定的温度范围内,胚胎发育过程会随温度升高而加快。同时, 在超过一定范围的温度条件下, 会导致胚胎发育畸形和死亡[14-16]。将一部分受精卵于25℃的高温进行孵化, 发现至少两个死亡高峰期, 囊胚期和原肠晚期(或是原口关闭期), 另外就是强烈的致畸作用: 高温条件下,鱼类过早达到胚胎发育的有效积温, 而细胞分裂的速度以及发生过程还远远滞后于此, 因此, 很多胚胎在尾芽形成后不久就孵化出膜(图1-29,1-30)。如上述, 由于卵黄囊膜十分脆弱, 过早孵化出的仔鱼会缺乏卵黄囊(卵黄囊膜破裂所致)甚至油球(图 1-29,1-30)。据文献报道和本文实验, 可以推测黑棘鲷胚胎发育的最佳温度为18~22℃。

本实验发现黑棘鲷的胚胎发育过程的特殊现象,例如卵黄囊膜的脆性, 双油球的存在以及龟裂结构等, 与以往的实验结论不同, 是否是与初次性成熟相关, 或者受到其他因素影响, 还需要进一步的观察和研究。

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Observation of embryonic development ofAcanthopagrus schlegelii

GUAN Shu-guang1, LIU Hong-jun1, LI Xiang-dong2, YU Dao-de1
(1. Mariculture Institute of Shandong Province, Qingdao 266002, China; 2. Yantai Baijia Fishery Limited Corporation, Yantai 265715, China)

Sep., 25, 2009

Acanthopagrus schlegelii; embryonic development; Kupffer’s vesicle

The naturally fertilized eggs of wild broodstock,Acanthopagrus schlegeliiwere collected by the flooding method in order to obtain developmentally synchronized embryos. The fertilized eggs were incubated in filtered sea water under subtle aerated conditions (salinity 32～33, 21.0 ℃± 0.5 ℃,and pH 7.8～8.2). The ontogenetic embryos were observed by Olympus SZ-61 microscope, the duration of every developmental stage was recorded, and the characteristic images were taken using a charge-coupled device (CCD). The fertilized eggs had globular, single oil globule and thin egg membrane, and the diameters of the eggs were in the range of 0.84 to 0.98 mm (n=30). During embryonic development, the main ontogenetic stages include blastodisc forming stage, cleavage stage, morula stage, blastula stage, gastrula stage, neurulation stage, organogenesis stage, tail bud stage, and heart beating stage. The time-table of major embryonic development stages was as follows: blastodisc forming stage at 40 m post fertilization; 4-cell stage at 1 h and 20min pf; morula at 3 h and 30 m pf; low blastula stage at 6 h 40 m pf; early gastrula stage at 7 h 20 min pf; late gastrula at 13 h pf; blastopore closing stage at 14 h 20 min pf; tail bud stage at 22 h 10 min pf; embryo movement at 28 h pf; 50%hatching stage at 32 h pf. High temperature (25℃) shortened the hatching period, but significantly increased embryo mortality rates and deformity rates.

S917.4; Q959.4

A

1000-3096(2011)09-0068-05

2009-09-25;

2010-05-25

农业部948项目(2011-z39); 山东省农业良种工程项目

官曙光(1963-), 男, 山东青岛人, 硕士, 主要从事鱼类学研究, 电话: 0532-82655167, E-mail: shuguang63@126.com; 于道德,通信作者, 理学博士, E-mail:wensentte@163.com

梁德海)