乳腺良恶性组织中UNC5B及VEGF的表达及相关性

向 芳 金 霞 殷先利 刘振洋 李 勇

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，每年约有30%以上的患者死于复发或转移，而血道和淋巴道转移是导致治疗失败的最常见原因。研究表明肿瘤的侵袭与转移同样伴随着新生血管形成。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是最重要的细胞因子之一,是特异性的血管内皮细胞促有丝分裂剂。研究发现[1]VEGF及其受体参与了肿瘤新生血管的形成，同时也是肿瘤抗血管治疗的靶点。最近的研究表明[2]，多种肿瘤都高表达VEGF，正常组织极少表达，而且肿瘤组织VEGF的表达水平与肿瘤复发、转移及预后密切相关。Park研究了神经生长因子Netrin-1及其受体UNC5B在新生血管轴突导向过程中的作用[3]，发现细胞表面受体UNC5B可以引导血管发育，UNC5B基因缺陷可以诱导血管内皮细胞的延伸，从而引起血管分支增加。

我们采用免疫组化的方法检测UNC5B和VEGF在乳腺癌和乳腺良性病变组织中的表达，分析UNC5B和VEGF表达与乳腺癌临床病理因素之间的关系及两者之间的相关性；再结合对患者的随访结果，采用Spearman相关性分析UNC5B在乳腺癌中的表达及意义，判断UNC5B对乳腺癌患者生存期的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

43例乳腺癌组织和20例乳腺良性病变组织石蜡标本均来自湖南省肿瘤医院2003年6月至2004年6月接受乳腺肿瘤切除的患者，乳腺癌患者平均年龄48.74岁,乳腺良性肿瘤患者平均年龄41.8岁。乳腺癌患者中21例为浸润性导管癌，22例为浸润性小叶癌；良性病变中7例纤维囊性乳腺病，6例乳腺腺病，7例纤维腺瘤。乳腺癌分期按2002年出版的《美国癌症联合委员会(AJCC)癌症分期手册》第6版的病理学TNM分期标准[4]进行确定：Ⅰ期3例，Ⅱa期15例，Ⅱb期10例，Ⅲa期12例，Ⅲc期3例。

1.2 试剂

兔抗人UNC5B单克隆抗体浓缩型、超敏链霉素抗生物素-过氧化物酶(Streptavidin-peroxidase SP)免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。兔抗人VEGF多克隆抗体购自福州迈新公司。工作液。PBS缓冲液和柠檬酸修复液由湖南省肿瘤医院病理科配制。

1.3 实验方法

全部标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续4 μm切片，常规HE染色。按照S-P免疫组化染色试剂盒说明书所示步骤进行UNC5B及VEGF染色。阴性对照：用已知阳性乳腺癌切片，以兔血清封闭液和同种属非免疫血清作空白对照，结果阴性。

1.4 结果判定

所有结果均由高年资病理科医生单独阅片。高倍镜下每张切片选择10个有代表性的视野，每个视野计数100 个肿瘤细胞，共计数1000 个细胞。阳性判断采用半定量标准[5]：①按染色强度计分“0”分为无色，“1” 分为淡棕黄色，“2”分为棕黄色，“3”分为红褐色；②按阳性染色细胞百分率计分：0分为阳性细胞数≤10%；1 分为阳性细胞数≤25 %；2 分为阳性细胞数≤50%；3 分为阳性细胞数>50%。然后将两类计分结果的乘积分为以下等级：0 分为(-)，1 ～ 2 分为(+)，3～4分为(++)，5分以上为(+++)。根据Mattern的判定标准，表达程度的划分界限是：阴性为(-)～(+)，阳性为(++)～(+++)。

1.5 统计学处理

用SPSS 17.0 Windows统计软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差表示；计数资料采用χ2检验；采用Spearman相关性分析。检验水准α=0.05，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 UNC5B及VEGF在乳腺肿瘤组织中表达的特点

2.1.1 UNC5B在乳腺肿瘤组织中表达的情况 UNC5B主要表达在肿瘤细胞胞质、胞膜中，呈棕黄至深棕色，边界清楚，无明显背景着色；UNC5B在20例良性乳腺肿瘤组织中均为强阳性表达。而在乳腺癌组织中的表达部分有下降，43例乳腺癌患者中阳性者24例(55.8%)，阴性者19例(44.2%)，恶性肿瘤组织中UNC5B表达明显低于良性肿瘤组织(χ2=12.653,P=0.0004)(见表1)。

2.1.2 VEGF在乳腺肿瘤组织中表达的情况 VEGF阳性表达主要位于肿瘤细胞胞质内，呈棕黄至深棕色,边界清楚。VEGF在20例乳腺良性组织中阳性率为10.0%(2/20)。VEGF在乳腺癌中的阳性表达率为65.1%(28/43)。VEGF在乳腺癌中的阳性表达率明显高于乳腺良性病变，两者之间有显著差异(χ2=16.625,P=0.0001)(见表1)。

表1 乳腺肿瘤UNC5B及VEGF表达情况(例，%)

2.2 UNC5B及VEGF的表达与乳腺癌临床病理因素间关系

UNC5B的表达与患者年龄、肿块大小、受体情况、临床分期、淋巴结转移数目及病理类型无关(P>0.05)。VEGF的表达与患者年龄、肿块大小、受体情况、临床分期及病理类型无关(P>0.05)；但与淋巴结转移情况相关。有淋巴结转移的VEGF阳性率表达较高，为91.7%；没有淋巴结转移的VEGF阳性率为37.5%，两者之间差异具有显著性(P<0.05)，见表2。

表2 乳腺癌UNC5B及VEGF的表达与临床病理关系

2.3 UNC5B及VEGF的表达与乳腺癌患者预后的关系

43例乳腺癌患者术后临床分期为Ⅰ～Ⅲ期，均未接受术前放化疗。经手术切除后均接受不同程度的放化疗及内分泌治疗，至2009年12月，43例患者均接受了6年以上随访。对43位乳腺癌患者的无病生存时间与UNC5B的表达情况进行Spearman分析后发现两者呈正相关(γ=0.307，P=0.045)，见表3。同样对43位乳腺癌患者的无病生存时间与VEGF的表达情况进行Spearman分析后发现两者呈负相关(γ=-0.456，P=0.002)，见表3。

表3 乳腺癌患者UNC5B及VEGF表达与无病生存期的相关性(例,%)

2.4 乳腺癌组织中UNC5B及VEGF表达之间的关系

采用直线相关分析，UNC5B与VEGF的表达呈负相关，相关系数γ=-0.342，P=0.019,见表4。

表4 乳腺癌中UNC5B及VEGF的表达的相关性(例)

3 讨论

形成新的血管是乳腺癌生长和转移的生物学基础。UNC5B作为1种神经生长因子(Netrin)受体，在引导血管生成上起到关键作用。

法国法兰西学院Anne Eichmann研究小组日前研究发现[6]，只有在蛋白受体UNC5B存在时，Netrin -1蛋白才能起到收缩内皮突起细胞丝状伪足的作用。当UNC5B受体遇到1个名为Netrin的分子时，就会发出信号阻止新生血管生长，使之不能过度延伸。该研究表明，血管内皮细胞中的UNC5B作为排斥Netrin蛋白的受体调控了血管系统的形态发育[7]。国内有研究显示UNC5B基因在HCC(肝细胞癌)组织血管内皮细胞及活化后的HUAEC(人脐动脉血管内皮细胞)中的表达均明显下调，提示UNC5B的表达下调可能与HCC的血管生成相关[8]。

破坏UNC5B可以诱导血管分叉，从而导致血管系统的错误导航，可以推测其与肿瘤的扩散转移有一定关联。我们研究发现UNC5B表达缺失的患者预后较差，其无病生存期也低于UNC5B阳性的乳腺癌患者，这是否意味着肿瘤血管在生成过程中由于缺乏UNC5B的导航，导致血管过度分叉，最终导致转移和复发？在本研究中，UNC5B表达与肿块大小，淋巴结转移数目和受体情况无明显相关性，与年龄，病理类型也无明显相关性。但在随访中发现，UNC5B表达缺失的患者的5年生存期明显低于UNC5B表达阳性的。这提示UNC5B表达缺失可能与乳腺癌患者的预后相关。但是由于我们研究的标本数量较少，UNC5B对患者预后的影响还有待进一步大样本的研究。

UNC5B在为数众多的肿瘤中表达缺失，相应的在这些肿瘤中由UNC5B介导的细胞凋亡通路也失活，从而导致细胞在细胞外胁迫压力下发生恶变。本研究发现乳腺恶性肿瘤UNC5B的表达与乳腺良性肿瘤有显著差别(表达缺失率44.18%，P<0.05)。这说明UNC5B基因表达缺失的确与乳腺癌的发生有一定关联。这与Thiebault等[9]的研究是一致的。我们可以推测UNC5B基因可能通过诱导细胞凋亡而对肿瘤生长起到负性调控作用。

VEGF是目前已知的最重要的促血管内皮生长因子之一。VEGF又称血管内皮生长因子，正常情况下，VEGF在人体许多正常组织中表达水平极低，而大多数恶性肿瘤存在VEGF高表达[10]。

我们在对43例乳腺癌组织和20例乳腺良性病变组织的VEGF表达进行了研究，发现VEGF在乳腺良性组织中阳性表达率仅10%，而乳腺癌组织中阳性表达率高达65.12%，两者之间有显著差异。说明VEGF过表达与肿瘤的发生及生长密切相关,目前研究认为肿瘤细胞和血管组成1个高度整合的生态系统，源于肿瘤细胞或相关炎性细胞的弥散信号促使内皮细胞从休克状态变为快速增殖状态[11]。

新生血管形成之后，肿瘤灶局部快速播散，增强肿瘤灶的远处转移能力[12]。我们研究发现VEGF表达阴性的预后较好，表达阳性预后较差，这一结果提示VEGF不仅参与了肿瘤的血管生成，还与肿瘤的转移和扩散密切相关。这与国内外研究结果是一致的[13，14]。

进一步研究发现有淋巴结转移者VEGF表达率较无淋巴结转移者高，统计学分析其差异具有显著性(P<0.05)。表明VEGF可以促进癌细胞通过血管-淋巴管连接进入淋巴循环发生转移，它还能促进基膜降解，有利于癌细胞迁移[15，16]。而乳腺癌组织中VEGF表达与肿块大小、患者年龄、病理类型及受体情况无关。这与国内外相关报道的结果是一致的[17]。

在本研究中我们对乳腺癌组织中的UNC5B及VEGF表达情况进行研究发现:VEGF表达与UNC5B呈负相关(P<0.05)。这说明：乳腺癌组织中UNC5B表达缺失导致血管异常导航，血管分支增加，从而导致血管密度增加和血管形态改变；而肿瘤组织中大量新生的血管需要血管内皮生长因子的诱导，故VEGF的表达上调。

因此同时阻断肿瘤组织中VEGF的表达和提高肿瘤组织中UNC5B的表达将在肿瘤的治疗中具有广阔前景。

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