以Kla值优化L-谷氨酸发酵的供氧条件

宋翔，魏文静，涂郑禹，孙玉春，陈宁

（1.天津渤海职业技术学院，天津300402；2.天津科技大学，天津300222）

以Kla值优化L-谷氨酸发酵的供氧条件

宋翔1，魏文静1，涂郑禹1，孙玉春1，陈宁2

（1.天津渤海职业技术学院，天津300402；2.天津科技大学，天津300222）

以Kla（体积溶氧系数）值为重要参考对黄色短杆菌进行了分批补料发酵过程中有关供氧条件的研究。在10L台式发酵罐中进行补料分批发酵，当Kla为377 h-1左右时，供氧比较适宜，可发酵产生130g/LL-谷氨酸。

L-谷氨酸；供氧；发酵；Kla值

谷氨酸化学名为α-氨基戊二酸，它是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有十分重要的意义。谷氨酸具有多种生理功能[，广泛用于食品，医药及饲料行业。谷氨酸发酵作为典型的代谢控制发酵，是工业微生物发酵工艺与过程控制的典型代表。1957年Kinoshita等[1]创立微生物发酵法生产谷氨酸，开创了发酵法氨基酸工业化生产的新纪元，使得发酵法生产氨基酸成为工业微生物最重要的研究领域之一[2～4]。

反应器中氧参与菌体生长、产物形成和细胞代谢。氧是难溶于水的气体，在室温及常压下，纯氧的溶解度仅为36 mg/L，空气中氧的溶解度仅为8 mg/L，当水中溶有糖或其它盐类时，氧的溶解度更低。在通风发酵中如何控制培养基中溶氧水平，对好氧氨基酸发酵非常关键，尤其在放大过程中，因反应器规模不同，造成溶氧水平的差异，是导致发酵结果不能重复的一个重要原因。在反应器放大研究中，Kla是一个重要的参数，不同规模的反应器中，氧传递系数与发酵结果之间存在着对应关系，目前Kla放大准则已成为生物化工界一个广泛接受的观点。可见在小型反应器中研究溶氧对发酵的影响，寻求最适Kla值不仅是发酵工业研究的关键之一，而且是反应器放大研究的重要基础。在谷氨酸发酵过程中，前期主要为菌体生长阶段，需要一定量氧参与，若氧的供应受到限制，就会影响菌体生长，进而影响到最终的L-谷氨酸产量;在L-谷氨酸合成阶段，氧也是必不可少的底物之一，供氧不足会严重影响L-谷氨酸的合成。

1 材料与方法

1.1 菌种

黄色短杆菌

1.2 培养基

[5]。

1.3 培养方法

1.3.1 斜面活化培养：32℃培养20 h。

1.3.2 种子培养：500mL圆底三角瓶中装液量30mL，9层纱布封口，置巡回式摇床（200 r/min）上，32℃振荡培养8 h。

1.3.310 L罐发酵：中装液量为6 L，接种量为10%，温度有34℃程序升温至39℃，通风比为1∶1，流加氨水控制pH在7.0～7.2，搅拌转速根据要求而定。

1.4 分析方法

1.4.1 pH的测定:用pH6.4～8.0精密pH试纸和发酵罐配套pH电极测定。

1.4.2 残糖测定:采用SBA-40C生物传感分析仪测定。

1.4.3 菌体浓度测定:稀释20倍，用752分光光度计在波长620 nm处测定。

1.4.4 谷氨酸含量的测定：采用SBA-40C生物传感分析仪测定。

2 结果与讨论

2.1 摇瓶溶氧系数的测定

为了给发酵放大提供依据，首先用亚硫酸盐氧化法对500 mL圆底三角瓶溶氧性能进行了测定。在相同摇瓶转速条件下（回转式摇床200 r/min），测定了不同装液量的摇瓶溶氧系数。结果见表1。

表1 摇瓶溶氧系数的确定

通过溶解氧性能测定可以看出，在固定摇床转速的条件下，对于同种规格的500 mL圆底三角瓶，减少装液量可以使溶氧加大。

2.210 L发酵罐溶氧系数的测定

要将摇瓶中的各项优化条件在大规模培养中完全重现是相当困难的，尤其是溶氧的控制尤为关键。为了使微生物培养过程溶解氧参数系统化，并有依据地将其放大进行工业化生产，在相同的通气量的条件下（200 L/h），本试验对不同的转速下10 L发酵罐的溶氧系数进行了测定。结果见表2。

表210 L发酵罐溶氧系数的测定

在相同的通气量的条件下，从试验测定的反应器中不同转速下的溶氧系数可知，当10 L发酵罐装液量为6 L，转速为500 r/min，通气量为200 L/h的溶氧系数，与回转式摇床500 mL三角瓶装液量30 mL时的溶氧系数接近。

2.3 Kla值与发酵罐溶氧的关系

已有的研究报道认为较低的溶氧有利于L-谷氨酸的积累。通过以上的实验研究表明摇瓶发酵过程中确定的最佳装液量为30 mL，溶氧系数为390 h-1，对应发酵罐的转速为500 r/min左右。试验中通过改变搅拌转速来控制不同的Kla值，在发酵培养基组成和其它发酵条件相同的情况下，考察了不同Kla值对应发酵过程溶氧变化的情况，结果见图1。

图1 10 L发酵罐不同Kla下溶解氧的变化

如图1所示，在控制不同的Kla值的发酵过程中，溶氧均表现出相似的变化规律，但发酵的不同阶段对氧的需求不同。在发酵初期（0～12 h），菌体好氧速率明显快于供氧速率，表现为溶氧的迅速下降；而18 h后，好氧速率和供氧速率基本保持平衡。发酵末期（30 h后），溶氧略有回升;发酵结束溶氧达10%左右。

2.4 Kla值对发酵产酸的影响

试验中通过改变搅拌转速控制不同的Kla值，从而达到控制发酵液的溶氧水平。发现过高或过低的溶氧对发酵均不利；当溶氧很低时（Kla=289 h-1）对发酵尤为不利，表现为产酸水平降低和发酵时间延长；将Kla值控制在377～512 h-1之间时，发酵结果较好，试验结果见表3。

表3 不同Kla值对发酵产酸的影响

2.5 不同Kla值时的发酵菌体生长曲线

图2为发酵过程中菌体生长曲线，在不同的Kla值时（除非Kla很小），菌体的生长量均能达到基本相同的饱和值，但菌体的生长速率是不同的。结果发现当Kla=377 h-1时，菌体的比生长速率最大；而过高的Kla值反而对菌体的生长有抑制作用。

图2 不同Kla值时的发酵菌体生长曲线

2.6 L-谷氨酸补料分批发酵过程曲线

以黄色短杆菌GDK-9为试验菌株，在7L自控发酵罐上进行L-谷氨酸发酵试验并绘制其发酵过程曲线，结果如图3所示。

图310 L发酵罐发酵过程曲线

由图3看出，0～2h为菌体生长的延滞期,此时菌体耗糖速率较慢,主要用于长菌,基本不产酸；2～ 12 h为菌体对数生长期,耗糖速率最快,并急剧产酸；12～36 h菌体进入稳定期,在此阶段,菌体耗糖速率较快,L-谷氨酸大量合成,36 h后为菌体衰退期,这时菌体耗糖速率减慢,L-谷氨酸合成缓慢或基本不合成。发酵36 h,L-谷氨酸产量为130 g/L。

参考文献：

［1］Kinoshita,S.,Udaka,S.,Shimono,M.,1957.Studies on the amino acid fermentation.I.Production of L-glutamic acid by various microorganisms[J].Gen.Appl.Microbiol.1957,3,193-205.

［2］Arnold L.Demain.Small bugs,big business the economic of the microbe[J].Biotechnology Advances,2000,18:499-514.

［3］ThomasHermann.Industrialproductionofaminoacidsbycoryneform bacteria[J].JournalofBiotechnology,2003,104:155-172.

［4］Volker F Wendisch,Michael Bott,Bernhard J Eikmanns.Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids[J]. Current Opinion in Microbiology,2006,92:68-274.

［5］郜培,陆静波,段作营,等.溶氧浓度对谷氨酸发醉关键酶的影响[J].食品与发酵工业,2005,31（10）：72-75.

Optimization of oxygen supply of L-glutamic acid fermentation by Kla value

SONG Xiang1,WEI Wen-jing1,TU Zheng-yu1,SUN Yu-chun1,CHEN Ning2
(1.Tianjin Bohai Vocational Technical College,Tianjin 300402,China；2.Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300222,China)

The oxygen supply of L-glutamic acid fermentation was optimized by Kla value.The research indicated that when the Kla value was about 377 h-1,the oxygen supply was most suitable for the fermentation and 130g/L L-glutamic acid was accumulated.

L-glutamic acid；oxygen supply；fermentation；Kla value

10.3969/j.issn.1008-1267.2011.03.008

TQ922+.1

A

1008-1267（2011）03-0026-03

2011-01-28