单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆*

韩宝芹,冯伊琳,毕庆庆,刘万顺,隋正红,杨官品

(中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)

血栓性疾病(脑血栓、冠心病、血栓栓塞性脉管炎、心肌梗塞等)一直严重威胁着人类的健康,这类疾病发病率高,死亡率高,致残率高,且疾病发生率随人口老龄化程度的加深而提高。据相关资料显示,全世界每年有1750万人死于心脑血管病,我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人,每年死于心脑血管疾病的患者多达300万,已成为心脑血管病发病和死亡最严重的国家[1]。

栓塞性疾病主要有3种治疗手段:外科手术,长期服用抗凝剂,药物溶栓。其中,溶栓药物治疗的方法最为重要也最具发展潜力。目前临床应用的溶栓药物虽然已经发展到第三代,但很多药物的疗效并不理想,存在着特异性差,副作用重,半衰期短等缺点,又或是生产不易,物稀价昂[2-5],因此,对于溶栓特异性好,半衰期长,生产制备容易的溶栓剂的开发需求迫切。

本实验室经多年研究,从海洋无脊椎动物单环刺螠(Urechis unicinctus)中分离出了1种新型纤溶酶,命名为单环刺螠纤溶酶(UFE)。该酶包括4个分子量组分,按照分子量由大到小,分别是单环刺螠纤溶酶Ⅰ,单环刺螠纤溶酶Ⅱ,单环刺螠纤溶酶Ⅲ和单环刺螠纤溶酶Ⅳ。4个单环刺螠纤溶酶组分均具有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安全性,故具有较大的开发价值[6-7]。但是从生物体中直接提取,以分离纯化的方法进行生产存在许多弊端,如生产工艺复杂,生产质量不稳定,产率低等。为解决上述问题,本研究克隆了该纤溶酶Ⅱ的全长cDNA序列,并通过生物信息学分析,初步确定其编码的蛋白质是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,为进一步开展基因工程菌的构建,重组活性蛋白的表达奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

单环刺螠购于青岛海产品市场。经分离纯化得到的单环刺螠纤溶酶Ⅱ(分子量26 kDa)纯品,本实验室制备。E.coli DH5α和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司;质粒pMD18-T,Ex Taq DNA聚合酶,PrimeScrip t 1st Strand cDNA Synthesis Kit,5′-Full RACE Kit等均购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质测序 单环刺螠纤溶酶Ⅱ蛋白质由北京华大蛋白质研究中心测序,得到N-末端序列:ICGGSPAD IT。

1.2.2 单环刺螠总RNA提取 用酸性酚-异硫氰酸胍法提取整个虫体总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量[8],并于-80℃保存备用。

1.2.3 cDNA第一链合成 根据Prime Scrip t 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行并用设计合成的3’RACE Adaptor:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGA TTTCACTA TAGGTTTTTT TTTTTTTTTT-3’替代试剂盒中自带的Oligo d T Primer做反转录引物,得到cDNA第一链。

1.2.4 简并PCR 根据已测定的单环刺螠纤溶酶ⅡN-端序列ICGGSPAD IT,设计简并正向引物103:5’-TCNCCNGCNGA YA THAC-3’,104:5’-AGYCCNGCNGA YA THAC-3’,根据3’RACE Adap tor设计反向引物OP:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGA TTT-3’。扩增体系:cDNA模板0.5μL,10×buffer 2.5μL,25mmol/L MgCl23μL,2.5 mmol/LdN TP 2μL,10μmol/L正向引物103/104 2.5μL,10μmol/L反向引物OP 1μL,ddH2O 13.3μL,r Taq DNA聚合0.2μL,总体积25μL。反应条件为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸10 min。扩增得到的PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收,回收产物与pMD18-T载体16℃过夜连接得连接载体。将连接载体用42℃热激法转化感受态E.coli DH5α,涂布含氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养。挑取培养基上的单克隆分别接种入含氨苄青霉素的液体LB培养基中,37℃培养扩增,用特异性引物103/104与OP进行菌落PCR验证阳性克隆,阳性菌株测序。

1.2.5 5’RACE PCR 根据5′-Full RACE Kit说明书进行5’-RACE PCR。所用特异性引物根据上述简并PCR产物测序结果设计,GSP1:5’-TTTACATGCGTTCGGCAATCCA-3’,GSP2:5’-ATTGTTGTAGTCGCTGTGCTCGTC-3’,扩增体系及参数见说明书,其中PCR退火温度为55℃。其他程序同1.2.4。

1.2.6 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)全长扩增根据5’RACE PCR测序结果设计正向引物stt:5’-GCGACTCCTGCA TTA TGAAGACTC-3’,根据简并引物PCR测序结果设计反向引物OP:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGA TTT-3’。扩增体系:cDNA模板1μL,TaKaRa Ex Taq 0.25μL,10×Ex Taq Buffer 5μL,2.5mmol/L dN TP4μL,10μmol/L正向引物stt 2μL,10μmol/L反向引物OP 2μL,ddH2O 35.75μL,总体积50μL。扩增条件中退火温度为55℃,其余程序同1.2.4。

1.2.7 生物信息学分析 cDNA序列使用NCB I BLASTx程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析,使用Bio Edit软件将cDNA序列翻译为氨基酸序列,对推导出的蛋白序列使用NCB I(http:∥www.ncbi,nlm,nih.gov/Structure)保守区域数据库CDD(Conserved Domain Database)以及PROSITE的ScanProsite软件(http://expasy.org/tools/scanp rosite/)进行蛋白质结构域及活性位点预测,SingalP程序分析信号肽。不同来源的丝氨酸蛋白酶家族成员用ClustalW创建1个多序列的比对结果,系统发生和进化的分析在比对的基础上用MEGA 4.0软件完成,系统树采用Neighbor_joining方法构建,bootstrap值为1 000。

2 结果与讨论

2.1 单环刺螠总RNA提取

新鲜虫体提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测,如图1所示,可见清晰的28s、18s、5s条带,无拖尾,总RNA质量良好,可用于逆转录反应。

图1 单环刺螠虫体总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose electrophoresis of total RNA from Urechis unicinctus

2.2 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)全长cDNA扩增

2.2.1 简并PCR 以总RNA为模板,3’RACE A dap tor为反向引物,反转录第一链cDNA。以此为模板,用引物103和OP扩增出大小约800 bp的产物(见图2)。

图2 简并PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Fig.2 Agarose electrophoresis of degenerated PCR

2.2.2 5’RACE PCR 根据简并PCR产物的测序结果设计引物,使用5′-Full RACE Kit(TaKaRa)扩增得到大小约400 bp的产物(见图3),测序结果与简并引物PCR扩增产物测序结果有228个碱基的重叠。

2.2.3 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)全长cDNA扩增 根据2次测序结果分别设计正反向引物扩增ufeⅡ全长,得到大小约800 bp的PCR产物(见图4)。

将扩增产物进行测序,该测序结果结合3’,5’RACE PCR测序结果的末端,得到单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因全长cDNA序列(见图5)。全长cDNA为906bp(GenBank accession number HM 623463),其中开放阅读框795 bp。

图3 5’RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Fig.3 Agarose electrophoresis of 5’RACE PCR

图4 全长cDNA扩增琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Agarose electrophoresis of full length cDNA amplification

图5 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因及其编码氨基酸序列方框中依次为:起始密码子,蛋白质N端序列,终止密码子Fig.5 Nucleo tide sequence and deduced amino acid sequence of the UFE cDNA.Boxes:start codon,protein Nterminal sequence,stopcodon

2.3 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因的生物信息学分析

2.3.1 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因同源序列分析BLASTx比对结果见图6。如图6所示,与本研究得到的序列的编码产物相似度较高的蛋白质为沙躅胰凝乳蛋白酶原,蚓激酶,蚯蚓纤溶酶,孢囊线虫和栉孔扇贝的丝氨酸蛋白酶等,因单环刺螠作为1种海洋生物,其基因组具有一定特殊性,故使用核苷酸序列比对时未见相似度高的序列。

图6 单环刺螠纤溶酶Ⅱ与其他蛋白质相似性比对Fig.6 Similarity comparison of amino acid sequence between amplified product and other proteins in database

图7 利用NJ法绘制的14种丝氨酸蛋白酶家族成员的进化树Fig.7 Neighbor-joining phylogenic tree of 14 different Protease amino acid sequences from serine p rotease family

本文比对了14个不同的丝氨酸蛋白酶家族成员并计算了它们的氨基酸相似性,利用M EGA软件对这些序列进行了分子系统学分析,在构建了系统发生树的基础上研究了单环刺螠纤溶酶Ⅱ和其他丝氨酸蛋白酶家族成员之间的进化关系(见图7)。结果显示,不同物种来源的丝氨酸蛋白酶在一定程度上是相关的。从系统进化树上可以看到,单环刺螠纤溶酶Ⅱ在进化上与来源于沙躅的胰凝乳蛋白酶原,以及蚓激酶等来源于蚯蚓的蛋白酶亲缘关系较近。

2.3.2 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因氨基酸序列保守性在NCB I(http:∥www.ncbi,nlm.nih.gov/Structure)保守区域数据库CDD(Conserved Domain Database)中分析单环刺螠纤溶酶Ⅱ氨基酸序列的保守性(见图8)。结果显示该酶属于胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族,通常为无活性前体酶原形式,经过限制性蛋白酶水解产生有活性的酶,剪切位置在第31-32氨基酸处,预测的剪切位置与蛋白质N端序列位置吻合。单环刺螠纤溶酶包含3个丝氨酸蛋白酶活性位点(催化三联体),并具有3个特异性底物结合位点。

图8 单环刺螠纤溶酶Ⅱ保守区分析Fig.8 Conserved domain analysis of UFEⅡ

使用PROSITE的Scan Prosite软件对氨基酸序列进行分析[9],该蛋白质含有1个tryp sin domain第32-264位,起始位点与蛋白质N端位置一致,其中第72位组氨酸(H)、第119位天冬氨酸(D)、第214位丝氨酸(S)为活性位点[10-11]。

2.3.3 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)氨基酸序列信号肽预测 根据http://cbs.dtu.dk/services/SignalP/中信号肽分析软件对单环刺螠纤溶酶Ⅱ氨基酸序列的分析,目标蛋白在第15和16个氨基酸之间被信号肽酶酶切的可能性最大,因此单环刺螠纤溶酶Ⅱ的信号肽应该是包含1～15个氨基酸残基的N端肽链。

2.3.4 单环刺螠纤溶酶Ⅱ分子量预测 单环刺螠纤溶酶Ⅱ前体肽氨基酸序列是根据基因序列推导出的,共有264个氨基酸,相对分子量为27030.59 Daltons(EditSeq),是分泌到胞外有活性的单环刺螠纤溶酶Ⅱ的未经过剪切加工的前体肽,根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure)保守区域数据库CDD(Conserved Domain Database)中分析,剪切后的活性蛋白质由32～264位氨基酸组成,即除了切除信号肽外还经过其它加工,需要再切除16个氨基酸长的肽段,分子量为23905.85 Daltons(EditSeq)。

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