阿片受体显像剂11C-Carfentanil的前体合成及放射性标记

张锦明,桂 媛,徐志红,张晓军,向晓辉,田嘉禾

1.中国人民解放军总医院核医学科,北京 100853;

2.江苏常熟华益化工有限公司,江苏常熟 215522;3.北京大学神经科学研究所,北京 100191

阿片受体显像剂11C-Carfentanil的前体合成及放射性标记

张锦明1,桂 媛2,徐志红2,张晓军1,向晓辉3,田嘉禾1

1.中国人民解放军总医院核医学科,北京 100853;

2.江苏常熟华益化工有限公司,江苏常熟 215522;3.北京大学神经科学研究所,北京 100191

为合成μ-阿片受体显像剂:1-(2-苯乙基)-4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-4-羧酸[11C]甲酯([11C]-methyl 1-phenethyl-4-(N-phenylpropanamido)piperidine-4-carboxylate,11C-CFN),合成了标记前体:1-苯乙基-4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-4-羧酸,并用11C标记。标记前体和各步合成中间体均经核磁和质谱确证。采用11CTriflate-CH3标记,Sep-Pak柱色层纯化,标记率为(67.3±2.3)%(n=3),产物放化纯度大于98%,比活度为1.67×1014Bq/g(66.6 PBq/mol),基本满足临床研究的需求。

11C;阿片受体;11C-Carfentanil;PET

11C标记的卡分太尼(11C-Carfentanil,11C-CFN)是一个选择性很强的μ-阿片受体显像剂,可用于人中枢神经μ-阿片受体的显像,以研究阿片受体的药理机制、针炙止痛的机理[1-2]。同时11C-CFN可用于研究癫痫、肺腺癌和烟酒等滥用的监测[3]。Dannals等[4]最先报道了合成11C-CFN,采用11CH3I与去甲基的钠盐前体加热反应,经 HPLC纯化,合成时间为30 min。Jewett[5]选用活性更高的11C-CH3-Triflate与前体在四丁基胺碱性条件下反应,采用固相萃取法,结合阴离子交换膜除放射性杂质,合成时间减小到10 min。Shao等[6]采用商业化模块自动化合成了11C-CFN,但合成效率只有40%,需进一步研究合成并提高其产率。国内最早合成了用于医疗的CFN,但采用CFN直接脱甲基合成CFN前体的效率低。本研究参照朱国政及Wadsak的合成方法[7-8],拟自行合成CFN的前体和标准品,采用11C-CH3-Triflate碱性条件下标记11C-CFN,改良的柱色层法纯化标记药物,以期达到较高的合成效率。

1 试剂和仪器

N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮、氰化钾、苯胺、浓硫酸、氢氧化钾、碘甲烷、丙酸酐、六次甲基磷酸三酰胺、Pd/C等购自上海阿拉丁试剂有限公司;冰醋酸购自国药试剂公司。所有试剂均为分析纯,购买后没有纯化直接使用。低本底1 mol/L氢化锂铝/THF,德国 ABX公司;DMSO,美国 Alfa Aesar公司;57%的氢碘酸、1 mol/L四丁基胺甲醇溶液,美国 Sigma-Aldrich公司;无水乙醇,美国Millennium公司;氨水,北京化工厂;Sep-Pak C-2柱 ,美国Alltech公司产品;GraceAlltimaC-18分析柱,5μm,10 mm×250 mm,美国 Grace公司。

Agilent 6120型质谱仪,美国安捷伦公司;Bruker 300M核磁共振仪,美国布鲁克公司;SGWX-4熔点仪,上海精密仪器厂;Sumitomo HM-20S回旋加速器,日本驻友公司;C-11碘代甲烷合成器,北京派特生物技术有限公司;高效 HPLC分析仪,美国 Waters公司,配515泵、2487紫外检测器、BioScan流动放射性检测器。API2000型LC/MS/MS,美国API公司。

2 实验方法

2.1 去甲基CFN和CFN标准品的合成

去甲基CFN和CFN标准品合成路线[7-8]示于图1。

2.1.1 4-哌啶乙腈 ,4-苯胺-1-(2-苯乙基)(1)的合成 将 N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮6.7 g和苯胺3.7 g溶于24.5 g冰醋酸中,室温搅拌下加入2.3 g KCN与2.5 g水的溶液,反应48 h后将反应混合物倒入水中,加氨水使其呈碱性,滤出所得固体,用异丙醇重结晶得固体5.7 g(产率55%),熔点118～123℃。

图1 11C-CFN前体和CFN标准品合成路线Fig.1 Reaction scheme for precursor of11C-CFN and CFN reference standards

2.1.2 4-哌啶甲酰胺,4-苯胺-1-(2-苯乙基)(2)的合成 将上述5.7 g产物1慢慢加入到20 mL浓硫酸中,搅拌反应24 h后将反应混合物倾到碎冰和氨水中,氯仿萃取,提取液干燥浓缩得固体,用异丙醇洗涤得产品3.8 g。

2.1.3 4-哌啶甲酸钠,4-苯胺-1-(2-苯乙基)(4)的合成 将2.1 g产品2、1.2 g氢氧化钾溶于10 mL的乙二醇中,加热回流20 h,冷却将反应物倒入水中过滤,滤液用盐酸酸化开始有沉淀生成,再加盐酸后沉淀溶解,加盐酸直到沉淀完全溶解。用浓的氢氧化钠碱化,该反应为放热反应,趁热过滤除不溶物,滤液冷却后,产物(4)结晶出来,过滤出固体再用水重结晶,得到产物0.92 g(产率41%)。

2.1.4 4-哌啶甲酸甲酯,4-苯胺-1-(2-苯乙基)(5)的合成 将0.46 g钠盐溶于5 mL六次甲基磷酸三酰胺(HMPA)中,加热至70℃搅拌,然后冷却至10℃加入碘甲烷0.22 g,反应物于室温下继续搅拌反应21 h。反应结束后加入5 mL甲苯,有机层用水洗涤,洗出的水相再用甲苯萃取,合并有机层,依次用w=10%的NaOH和饱和食盐水洗涤,干燥过滤浓缩得粗产品,柱分离得产品0.17 g(产率38%),熔点95～99 ℃。

2.1.5 4-哌啶甲酸甲酯,4-[(1-丙酰基)苯胺]-1-(2-苯乙基)(6)的合成 将上述0.17 g产品5与丙酸酐1 mL混合,搅拌下回流6 h,冷却至室温后倾入水中,加入氨水至碱性。氯仿提取,提取液用水洗涤后干燥,过滤浓缩得油状物,将其溶于少量异丙醇中加入草酸形成草酸盐,过滤得白色固体0.17 g。经碱化、提取、干燥,然后减压浓缩得到油状物0.11 g,即为CFN标准品(产率56%)。

2.1.6 4-哌啶甲酸苯甲醇酯,4-苯胺-1-(2-苯乙基)(7)的合成 将0.46 g钠盐溶于5 mL六次甲基磷酸三酰胺(HMPA)中,加热至110℃搅拌然后冷却至20℃加入氯化苄0.15 g,反应物于室温下继续搅拌反应18 h。反应结束后将混合物倒入水中,用甲苯萃取,合并有机层,用饱和食盐水洗涤,干燥过滤浓缩得粗产品,柱分离得产品0.18 g(产率32%),熔点75～78 ℃。

2.1.7 4-哌啶甲酸苯甲醇酯,1-(2-苯乙基)-4-(N-苯基丙酰胺基)(8)的合成 将上述0.18 g产品7与丙酸酐5 mL混合,搅拌下回流6 h,冷却至室温后倾入水中,加入氨水至碱性。氯仿提取,提取液用水洗涤后干燥,过滤浓缩得油状物,将其溶于少量异丙醇中加入草酸形成草酸盐,过滤得白色固体0.13 g。经碱化、提取、干燥,然后减压浓缩得到固体0.1 g(产率45%)。

2.1.8 4-哌啶甲酸,1-(2-苯乙基)-4-(N-苯基丙酰胺基)(9)的合成 将90 mg产品8溶于10 mL无水乙醇中,加入 10%Pd/C 20 mg,(2～3)×105Pa下室温通入氢气脱去苄基,搅拌约16 h,过滤除去催化剂,滤饼用乙醇洗涤,将滤液浓缩得到固体物质,将其柱分离后得到最终白色固体产物14.5 mg(产率 20%)。

2.2 11C碘代甲烷的生产及11C-CH3-Triflate的合成

用 SumitomoHM-20S回旋加速器 40μA 20 MeV质子轰击含φ=1%氧的天然氮气靶,通过14N(p,α)11C核反应生成11C-CO2。[11C]-CH3I由单管、液相法由11C碘代甲烷仪自动化合成[9],即生成的11C-CO2由液氮捕获后,由氮气以30 mL/min速率载带入0.2 mL 1 mol/L氢化锂铝/THF中,然后加热除 THF,加入0.2 mLw=57%的氢碘酸,生成的11C-CH3I由氮气载带,进入 T riflate转化炉;11C-CH3I经在线转化成11C-CH3-Triflate[10]。

2.3 11C-CFN的标记及纯化

1.0 mg的去甲基 CFN酸前体,用0.2 mL DMSO溶解,加入2.6μL 1 mol/L四丁基胺甲醇溶液。将上述制备的11CH3-Triflate通入该溶液。该溶液用10 mLφ=10%氨水稀释,混合液过C-2柱,用10 mL水清洗该柱,最后用1.0 mL无水乙醇将产品从C-2柱上洗脱,加入9 mL水即可。

2.4 11C-CFN质量控制

采用 HPLC分析产品的放化纯度,分析柱为C-18柱,流动相为30%MeCN/水(1L水加2 mL冰乙酸),流速为1 mL/min。11C-CFN的保留时间为5.3 min。采用LC/MS/MS测量11C-CFN的比活度[11]。首先需配制不同浓度的 CFN标准品,由LC/MS/MS测得不同浓度下CFN标准品的质量数峰值为395.2,根据浓度和峰面积作图为线性(r2=0.999 9),依据11C-CFN在相同质量数下的峰面积,计算CFN的浓度,根据其放射化学浓度,计算11C-CFN的比活度。

3 结果和讨论

3.1 CFN标准品和CFN标记前体的合成与表征

本研究合成从较易得到的原料出发,最终合成了CFN的标准品(6)和CFN的标记前体(9),从 N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮开始计算,总体产率为0.22%。

其中化合物2:MS(m/e):324.2;1H NMR(300 MHz,DMSO,δ):7.13～7.30(m,6H),6.95～7.09(m,3H),6.52～6.63(m,3H),2.57～2.75(m,4H),2.42～2.50(M,2H),2.20～2.33(m,2H),1.90～2.04(m,2H),1.78～1.89(m,2H)。

化合物3:1H NMR(300 MHz,DMSO,δ):7.12～7.30(m,5H),6.87～6.95(m,2H),6.60～6.68(m,2H),6.32～6.41(m,1H),2.65～2.75(m,4H),2.40～2.50(m,2H),2.26～2.40(m,2H),1.92～2.05(m,2H),1.72～1.84(m,2H)。

化合物5:MS(m/e):339.2;1H NMR(300 MHz,CDCl3,δ):7.25～7.32(m,2H),7.11～7.22(m,5H),6.72～6.79(m,1H),6.55～6.62(m,2H),3.85(br,1H),3.68(s,3H),2.75～2.85(m,2H),2.57～2.75(m,4H),2.43～2.56(m,2H),2.20～2.35(m,2H),2.00～2.13(m,2H)。

化合物6:MS(m/e):395.2;1H NMR(300 MHz,CDCl3,δ):7.38～7.46(m,3H),7.30～7.35(m,2H),7.21～7.29(m,2H),7.11～7.20(m,3H),3.80(s,3H),2.67～2.80(m,4H),2.39～2.62(m,4H),2.26～2.38(m,2H),1.88(q,2H,J=7.5 Hz),1.60～1.74(m,2H),0.96(t,3H,J=7.5 Hz)。

化合物8:MS(m/e):471.2;1H NMR(300 MHz,CDCl3,δ):7.21～7.44(m,12H),7.09～7.20(m,3H),5.25(s,2H),2.63～2.75(m,4H),2.41～2.57(m,4H),2.28～2.39(m,2H),1.85(q,2H,J=7.5 Hz),1.60～1.74(m,2H),0.94(t,3H,J=7.5 Hz)。

化合物9:MS(m/e):381.2;1H NMR(300 MHz,DMSO,δ):12.30(1H),7.41～7.51(m,3H),7.35～7.40(m,2H),7.21～7.26(m,2H),7.14～7.18(m,3H),2.55～2.70(m,4H),2.38～2.50(m,4H),2.08～2.15(m,2H),1.78(q,2H,J=7.5 Hz),1.50～1.60(m,2H),0.82(t,3H,J=7.5 Hz)。

与朱国政等[7]的合成方法相比,本研究在从物质3合成5、7的时候,增加了成盐这一步,由于成盐后溶液的p H为中性,甲基化及苄基化时无需再加碱,甲基化时不受碱量的影响,因此产率增加,显著提高了合成产率。

3.2 11C-CFN的标记及纯化结果

在常温、碱性条件下,前体易与11C-CH3-Triflate反应,从11C-CH3I的放射性活度计算,11C-CFN的标记率为(67.3±2.3)%(n=3)。经 HPLC分析,产品的放化纯度大于98%,有二个杂质峰(图2),一个是与溶剂相对应的 tR=2.36 min的峰,该峰为水溶性的11C-CH3-Triflate峰,另一是未知副产品的tR=4.29 min杂质峰。图2中紫外吸收峰为共进样CFN标准品的吸收峰(死体积已校正),该峰与放射性峰一致,说明放射性主峰tR=5.31 min即为CFN。由于采用ABX公司低本底1 mol/L氢化锂铝/THF,标记物的 tR=5.31 min处的紫外吸收峰很小(未列),紫外测量受干扰,经LC/MS/MS测量,11C-CFN的比活度为1.67×1014Bq/g(66.6 PBq/mol)。患者注射剂量为每人370 MBq,则单个患者接受注射的CFN量为2.2μg。CFN的安全剂量为10μg,因此,本法合成的11C-CFN放射化学纯度和比活度基本满足临床研究的需求。

图2 11C-CFN的HPLC分析放射性和标准品的UVFig.2 Profiles of analytical of formulation11C-CFN and UV of CFN reference standards

本方法的标记率明显高于文献[6]上的40%。采用11C-CH3-Triflate甲基化的优点除其活性大外,11C-CH3-Triflate本身是水溶性,而11C-CH3I为脂溶性[10],在制备中枢神经受体药物时,可容易将产品吸附在固相柱上,未反应的11CCH3-Triflate通过水清洗固相柱达到纯化的目的;而脂溶性的11C-CH3I常与产品混在一起,用固相柱不易分开。

本研究的纯化方法与文献[5-6]相比有一定区别:本方法未采用正丁醇,同时也没有采用阴离子柱;而直接采用C-2柱吸附、清洗和洗脱,采用C-2柱可最大限度去除标记前体,少量的去甲基CFN酸前体价态为负一价,在血液中无法进入大脑血脑屏障(BBB);动物实验证实,尽管CFN的毒性很大,但其前体去甲基CFN酸则毒性很低,注射50μg/g前体于小鼠,未观察到小鼠中毒症状。采用阴离子柱的目的是提高产品的放化纯度,从图2可见,虽然没有采用阴离子柱纯化,但本产品放化纯度仍达到98%。

3.3 11C-CFN的副反应

为提高11C-CFN的甲基化产率,在前体溶液中通入11CH3-Triflate后,反应液加热至80℃反应5 min,同样方法纯化,发现产品放化纯度下降,同时出现了2个脂溶性放射性峰(图3),且tR发生了变化。经共进CFN标准品发现,tR=6.1 min的为产品,tR=4.2 min的为放化杂质,结构未知。

图3 11C-CFN的副反应的HPLC峰Fig.3 Analytical HPLC of by-production of11C-CFN

在标记前体1-苯乙基-4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-4-羧酸上,可甲基化的位置共有3个:第一是产品的羧基位;第二是哌啶环上的氮原子,甲基化后生成季铵盐,但本实验采用阳离子交换柱Sep-Pak CM未能分离到该产品,可能是受溶液中其它离子干扰的缘故;第三是苯胺上的氮原子,但该原子受邻位羰基和苯环空间位阻的影响,亲核力很小。因此最有可能的副反应是第二种。本工作尝试用质谱分析副产物,发现其分子量与产品一致,说明仍是前体甲基化产品,仅是标在了其它位置,经生物学验证,该副产品不能进入BBB(另文报道)。

早期的文献采用加热的方法没有发现这类副反应,可能是他们均采用了活性较小的碘代甲烷作甲基化试剂。因此采用高活性的11C-CH3-Triflate作甲基化试剂,无需加热,常温下即可发生反应;加热后副反应会增加,需经 HPLC纯化。

4 结 论

本研究从较易得的试剂1-苄基-4-哌啶酮为原料合成了11C-CFN的前体:1-苯乙基-4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-4-羧酸和标准品,标准品对分析副反应有很大帮助。采用11C-CH3-Triflate可在常温下与前体反应,直接采用C-2柱吸附、清洗和洗脱,标记率为(67.3±2.3)%(n=3),产品的放化纯度大于98%,比活度为1.67 ×1014Bq/g(66.6 PBq/mol)。

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Organic Synthesis of Precursor and Radiolabelling of11C-Carfentanil as Opiate Receptor Imaging Agent

ZHANGJin-ming1,GUI Yuan2,XU Zhi-hong2,ZHANG Xiao-jun1,XIANG Xiao-hui3,TIAN Jia-he1
1.Department of Nuclear Medicine,The PLA General Hospital,Beijing 100853,China;
2.Huayi Chemicals Co.Ltd.,Changshu 215522,China;
3.Neuroscience Research Institute,Peking University,Beijing 100191,China

The[11C]-methyl 1-phenethyl-4-(N-phenylpropanamido)piperidine-4-carboxylate(11C-Carfentanil)asμopiate receptor imaging agent and its precursor have been synthesized.The precursor has been confirmed by1H NMR and MS.11C-Carfentanil was prepared without using HPLC purification.Labeling yields,radiochemistry purity and specific activity are(67.3±2.3)%(n=3),98%and 1.67×1014Bq/g(66.6 PBq/mol)respectively.

11C;opiate receptor;11C-Carfentanil;PET

TL923

A

0253-9950(2011)04-0252-05

2010-07-08;

2010-12-13

国家重点研究发展计划(973)支持项目(2007CB512500)

张锦明(1965—),男,江苏南通人,博士,研究员,核医学专业