细胞凋亡显像剂[18F]FEDPA的合成和标记

郭新艳,王红亮,金燕锋,刘英华,唐刚华,姜申德,＊

1.天津大学药物科学与技术学院,天津 300072;

2.中山大学附属第一医院核医学科 PET-CT中心,广东广州 510080

细胞凋亡显像剂[18F]FEDPA的合成和标记

郭新艳1,王红亮1,金燕锋1,刘英华1,唐刚华2,＊,姜申德1,＊

1.天津大学药物科学与技术学院,天津 300072;

2.中山大学附属第一医院核医学科 PET-CT中心,广东广州 510080

为制备新型细胞凋亡显像剂[18F]FEDPA,合成了前体(2-{2-[2-(3,5-二-N,N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-胺,总收率5%(以化合物4计)。后经过18F标记合成[18F]FEDPA,标记率(8.9±0.3)%(经校正,n=2),HPLC检测其放射化学纯度为77%。

18F-标记;细胞凋亡;[18F]FEDPA;合成

正电子发射断层成像(PET)是研究正电子类放射性显像剂(18F,11C,15O和13N等核素标记的显像剂)在生物体内代谢分布的一种功能性显像技术,近年来在医学研究、临床诊断及新药研发等方面都有广泛应用[1]。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在保证多细胞生物的细胞分化、器官发育中起着重要的作用。细胞凋亡与许多疾病诸如肿瘤、阿尔茨海默病、帕金森病等有着重要的联系[2]。磷脂酰丝氨酸(PS)存在于正常细胞的细胞膜内部,细胞发生凋亡的早期,PS就会外翻到细胞膜的外层,蛋白质Annexin V可以特异性地与 PS结合[3-4]。目前细胞凋亡的检测主要是将显像基团引入到 Annexin V中,如Annexin V-FITC,通过荧光基团检测细胞凋亡情况[5];而99Tcm-Annexin V是一类研究较为透彻、应用较广的放射性活体细胞凋亡显像剂,已进入临床试验阶段,应用于疾病细胞凋亡检测以及恶性肿瘤放化疗的疗效评价等[6]。但是,Annexin V有一定的缺点:Annexin V是一种蛋白质,相对分子质量较大(3.6×104),易降解,体内结合速率和血液清除较慢[7]。

近期,Smith小组设计出可以与PS特异性结合的具有二吡啶甲基胺(DPA)基团的荧光大分子化合物,PSS-480(图1)。锌络合的二吡啶甲基胺与PS产生特异性结合后,通过荧光显微镜可进行体外细胞凋亡检测[8]。

图1 PSS-480结构Fig.1 Structure of PSS-480

为了研究用于体内细胞凋亡检测的PET显像剂,本工作采用锌络合的二吡啶甲基胺类化合物为框架结构,设计核素18F标记的新型细胞凋亡显像剂[18F]FEDPA,并报道[18F]FEDPA的放射合成及其前体的有机合成。

1 仪器与试剂

Reichert-Thermovar熔点仪,奥地利 Reichert公司;N-1001型旋转蒸发仪,上海爱朗仪器公司;Bruker AvanceⅢ400 MHz核磁仪,德国Bruker公司;Merck 60F254硅胶板,德国 Merck公司;Kugelrohr GKR-50高温蒸馏仪,瑞士Buchi公司;硅胶,粒径0.037～0.056 mm,烟台化学工业研究所;Cyclone 10/5型回旋加速器,比利时IBA公司;PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模块,北京派特生物有限公司;CRC-15R放射性活度计,美国CAPINTEC公司;1200 Series高效液相分析色谱仪(HPLC),美国Agilent公司;流动相放射性检测器,B-FC-3200高能 PMT检测器,美国华盛顿BIOSCAN公司。所用试剂均为分析纯或化学纯。

2 实验方法

2.1 [18F]FEDPA前体的合成路线

[18F]FEDPA的逆合成路线示于图2。其中前体1经多步有机反应合成,其合成路线示于图3—5。

2.2 实验步骤

2.2.1 二甲基吡啶胺(化合物3)的合成[9]2-氰基吡啶(15 g,144 mmol),1.2 g Pd/C(Pd的质量分数为5%),加入乙醇水溶液(V(乙醇)∶V(水)=6∶1)。用氢气置换高压釜内空气6次,然后加压至2×106Pa,控温25℃,搅拌反应5 h,反应完毕。过滤除去Pd/C,减压蒸去溶剂,得到黄色油状液体15.17 g。Kugelrohr高温蒸馏仪纯化,真空度150 mm汞柱,除去170℃馏分,收集270℃馏分,得到8.83 g化合物3,为金黄色透明液体,收率30%。

2.2.2 (2-[2-(2-叠氮基)乙氧基]乙氧基)-乙醇(化合物 5)的合成[10]三缩乙二醇(10.5 g,70 mmol)溶于150 mL干燥的四氢呋喃,加入三乙胺(15 mL,50 mmol),将体系冷却至0℃,滴入甲磺酰氯(3.87 mL,25 mmol),室温搅拌1 h。将反应液蒸干,加入蒸馏水30 mL,乙酸乙酯萃取(30 mL×3),无水硫酸钠干燥、浓缩,得到浅黄色油状液体4.25 g。加入30 mL乙醇中,将叠氮化钠(3.25 g,50 mmol)溶于10 mL蒸馏水,滴加到反应溶液中,体系加热到50℃,反应7 h。加入100 mL蒸馏水,80 mL乙酸乙酯,搅拌分液。乙酸乙酯萃取(100 mL×4),合并有机层,无水硫酸钠干燥、浓缩,硅胶柱层析分离(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶9),得到1.69 g化合物5,收率38%。

图2 目标化合物的逆合成分析Fig.2 Retrosynthetic analysis of target compounds

图3 化合物3的合成Fig.3 Synthesis of compound 3

图4 化合物7的合成Fig.4 Synthesis of compound 7

2.2.3 2-[2-(2-叔丁氧酰胺基)乙氧基]乙氧基-乙醇(化合物 6)的合成 化合物 5(1.69 g,9.65 mmol)溶于50 mL四氢呋喃中,加入三苯基磷(2.53 g,9.65 mmol),液封,室温反应30 min,加入10 mL蒸馏水,室温搅拌反应15 h。加盐酸水溶液调p H=3,加入30 mL乙酸乙酯,分离水层,有机层用蒸馏水(30 mL×3)萃取,将水层合并,氢氧化钠调p H=13。加入(Boc)2O(3.16 g,14.47 mmol),室温反应30 min,乙酸乙酯萃取(70 mL×3),收集有机相,用无水硫酸钠干燥,旋干得到3.80 g化合物6粗品。

2.2.4 2-(2-(2-(叔丁氧羰基)乙氧基)乙氧基)对甲磺酸乙酯(化合物7)的合成 化合物6粗品(3.37 g,13.5 mmol)溶于20 mL干燥的二氯甲烷中,冰浴冷却后加入三乙胺(2.34mL,16.2 mmol),接着滴入对甲苯磺酰氯(3.08 g,16.2 mmol),滴加完毕后,室温反应过夜。将反应液旋干,加入蒸馏水,乙酸乙酯(20 mL×3)萃取,合并有机相。无水硫酸钠干燥,旋干溶剂,得黄色透明油状物,硅胶柱层析分离(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶2)得到化合物7纯品3.50 g,收率83%。

图5 前体1的合成Fig.5 Synthesis of compound 1

2.2.5 (2-{2-[2-(3,5-二羟甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(化合物9)的合成 将化合物7(2.3 g,7.34 mmol)、3,5-二羟甲基苯酚(1.13 g,7.34 mmol)、无水碳酸钾(3.04 g,22.02 mmol)、20 mL乙腈加入到烧瓶中,加热回流反应11 h。将反应体系中的乙腈蒸干,加入20 mL蒸馏水,氢氧化钠调p H=13,乙酸乙酯萃取(20 mL×3)。合并有机层,无水硫酸钠干燥、浓缩,硅胶柱层析分离(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶8),得到化合物9黄色油状液体1.32 g,收率47%。

2.2.6 (2-{2-[2-(3,5-二甲磺酰氧基甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(化合物10)的合成 化合物9(1.32 g,3.42 mmol)溶于10 mL干燥的二氯甲烷中,冰浴冷却至0℃,加入三乙胺(2.08 g,20.54 mmol),滴入甲磺酰氯(2.35 g,20.54 mmol),室温反应1 h。减压蒸出溶剂,加入20 mL蒸馏水,二氯甲烷萃取(20 mL×3),合并有机相,无水硫酸钠干燥后,浓缩,柱层析(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶2),得到化合物10无色液体1.23 g,收率66%。

2.2.7 (2-{2-[2-(3,5-二-N,N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(化合物11)的合成[11]将化合物10(1.15 g,2.12 mmol)溶于25 mL乙腈中,加入无水碳酸钾(1.17 g,8.46 mmol)、二甲基吡啶胺(1.06 g,5.3 mmol),氩气保护,室温反应过夜。先将乙腈蒸出,加入蒸馏水15 mL,乙酸乙酯萃取(20 mL×3),合并有机相。无水硫酸钠干燥,蒸干溶剂,得到化合物11棕黄色油状液体1.71 g。

2.2.8 (2-{2-[2-(3,5-二-N,N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-胺(前体1)的合成 将化合物11粗品1.71 g,加入10 mL二氯甲烷充分溶解,冰浴冷却,滴加三氟乙酸的二氯甲烷溶液(φ=50%)10 mL,室温反应4 h。减压蒸出溶剂,加入饱和碳酸钠溶液调p H=10,二氯甲烷萃取(20 mL×4),合并有机相。干燥、浓缩,得到棕红色油状液体,硅胶柱层析分离(V(乙酸乙酯)∶V(氨的甲醇溶液)=5∶1,氨的甲醇溶液浓度为4.11 mol/L),得到纯品0.69 g,两步反应收率50%。

2.3 [18F]FEDPA的制备

在合成[18F]FEOTs时,采用文献[12]中的方法,二对甲苯磺酸乙二醇酯和[18F]KF在100℃下反应6 min。经 Sep Pak SiO2小柱分离纯化后,得到放化纯度大于95%的[18F]FEOTs,然后与前体1反应。[18F]FEDPA的合成路线示于图6。

图6 [18F]FEDPA的合成Fig.6 Synthesis of[18F]FEDPA

用氟多功能合成模块(图7)进行18F标记,具体标记操作如下:

(1)18F-由 Cyclone 10/5通过18O(p,n)18F反应生产;

(2)18F-被 QMA捕获后,用瓶 a中的1.5 mL K2CO3和 K222混合液(30 mg/1 mL水溶液-130 mg/10 mL K222乙腈溶液)将其洗脱,进入反应管Ⅰ中;

(3)在116℃加热反应管6 min,蒸发溶剂;冷却后加入瓶b中的乙腈,116℃蒸干溶剂,干燥反应管至无液体残留,然后冷却;

(4)瓶c中加入二对甲苯磺酸乙二醇酯(8 mg)的乙腈(1 mL)溶液,100℃下密闭反应6 min,浓缩反应溶液后,冷却反应管;

(5)瓶d中的乙醚(5 mL)加入到反应管Ⅰ;

(6)将反应液通过V7与V10之间相连的Sep Pak SiO2小柱,液体进入反应管Ⅱ中(装有碳酸钾8 mg),并在90℃下将乙醚蒸除;

(7)重复(5)和(6)中的操作;

(8)瓶g中加入前体化合物1(5 mg)的DMF溶液至反应管Ⅱ,135℃下密闭反应30 min,反应结束后冷却反应管;

(9)瓶 h中加入15 mL水,将反应液通过V15和 V17之间的 Sep Pak Al2O3和 Sep Pak C18小柱后进入废液,并用氮气吹干小柱。

(10)加入瓶i中的1 mL无水乙醇到反应管Ⅱ,经 Sep Pak Al2O3和 Sep Pak C18 后 ,加入0.1 mol/L硝酸锌乙醇溶液2.31μL,密闭反应10 min后,70℃下浓缩溶液,至溶液完全蒸干,加入生理盐水配置溶液,过无菌滤膜后接入产品瓶中。

3 结果与讨论

3.1 [18F]FEDPA前体的合成

Hanshaw等[8]的合成路线是以3,5-二羟甲基苯酚为起始原料,经过缩合、溴代、胺化、脱保护基等反应制备前体1。本工作分3部分合成了前体1:2-氰基吡啶经过催化氢化制备二甲基吡啶胺(化合物3),收率30%;三乙二醇为起始原料,经酯化、叠氮化、还原、Boc保护和取代反应制备化合物7;最后以化合物3、7、8,经过四步反应完成了前体1的合成,并采用氨的甲醇溶液作为洗脱剂,得到目标前体1的纯品,收率5%(以化合物4计)。在合成化合物7时,采用甲磺酰酯基替代原路线中的溴作为离去基团,提高了收率。

图7 合成模块的路线图Fig.7 Scheme of disposable cassette

3.2 产物的鉴定分析

化合物 1:1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:8.51(d,4H,J=4.2 Hz),7.56～7.85(m,8H),7.11～7.14(m,4H),7.07(s,1H),6.89(s,2H),4.08～4.15(m,2H),3.86～3.89(m,2H),3.80(s,8H),3.70～3.74(m,2H),3.64(s,4H),3.53(t,2H,J=5.2 Hz),2.87(t,2H,J=5.2 Hz),2.08(s,2H)。

产品用 HPLC分析(Alltima C18,150 mm×4.6 mm,5μm),结果示于图8。由图 8可以看出,[18F]FEDPA的保留时间为11.9 min,标准品[19F]FEDPA的保留时间为11.6 min。放射化学纯度为77%(乙腈/0.1 mol/L甲酸铵水溶液:30/70,流速为1 mL/min,254 nm UV检测)。[18F]FEOTs在碱性条件下进行烷基化反应时,发生部分水解,致使采用Sep Pak C18小柱分离的方法纯化后的产物中仍带有部分水解产物,造成目标产物的放射化学纯度较低。

图8 [18F]FEDPA的放射性 HPLC图谱(a)和FEDPA紫外 HPLC图谱(b)Fig.8 Radioactive(a)and UV(b)chromatogram of the prepared FEDPA

3.3 氟化标记反应条件的选择

在进行前体1的[18F]氟乙基化反应时,作者尝试了很多反应条件,得到产物[18F]FEDPA的标记率都很低(表1)。

表1 不同条件下合成[18F]FEDPA的标记率Table 1 Radiochemical yield of[18F]FEDPAat different conditions

最后选定以DMF为溶剂,以 K2CO3为碱在135℃下反应30 min,得到[18F]FEDPA,标记率(8.9±0.3)%(n=2)。分析造成[18F]FEDPA放化收率低的主要原因是:(1)[18F]FEOTs的化学纯度较低;(2)前体1的烷基化效率较低,且合成时间长,造成目标产物的标记率偏低,有待进一步优化。

4 结 论

[18F]FEDPA是自行设计的一种检测细胞凋亡的二甲基吡啶胺类PET显像剂。本研究对前体1的全合成路线进行了改进,并以化合物1作为前体进行了18F标记制备[18F]FEDPA,合成时间是 105 min,标记率(8.9±0.3)%(经校正,n=2),HPLC检测放射化学纯度为77%。

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Synthesis and Radiolabelling of[18F]FEDPA as an Imaging Agent for Apoptosis

GUO Xin-yan1,WANG Hong-liang1,J IN Yan-feng1,LIU Ying-hua1,TANG Gang-hua2,＊,J IANG Shen-de1,＊
1.School of Pharmaceutical Science and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,China;
2.PET-CT Center of Department of Nuclear Medicine,The First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510080,China

Synthesis and fluoro-radiolabelling of apoptosis imaging agent[18F]FEDPA were reported.The labeling precursor 2-{2-[2-(3,5-bis(2,2’-dipicolyaminomeyhyl)-phenoxy)ethoxy]-ethoxy}ethyl amine was prepared with the total yield of 5%(based on compound 4).18F-labeling of the precursor gave[18F]FEDPA.The radiochemical yield is(8.9±0.3)%(n=2,decay corrected)and radiochemical purity is 77%determined by HPLC.

18F-labeling;apoptosis;[18F]FEDPA;synthesis

TL923

A

0253-9950(2011)04-0245-07

2010-09-02;

2010-12-21

国家自然科学基金资助项目(30970856);国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2008AA02Z430)

郭新艳(1985—),女,山东烟台人,硕士研究生,药物化学专业

＊通信联系人:唐刚华,男,教授,博士生导师,主要从事放射性药物与分子影像学研究,E-mail:gtang0224@yahoo.com.cn

姜申德,男,教授,博士生导师,主要从事有机合成研究,E-mail:jianggroup@tju.edu.cn