超高效液相色谱法测定烟用香精中的欧前胡素

王雪莹 陆舍铭 朱 丽 孟昭宇 曹秋娥

（1.红塔烟草集团有限责任公司技术中心，玉溪 653100； 2.云南大学化学科学与工程学院，昆明 650091）

超高效液相色谱法测定烟用香精中的欧前胡素

王雪莹1，2陆舍铭1朱 丽1孟昭宇1曹秋娥2

（1.红塔烟草集团有限责任公司技术中心，玉溪 653100； 2.云南大学化学科学与工程学院，昆明 650091）

建立了测定烟用香精中欧前胡素的超高效液相色谱方法。以体积比为1∶1的乙腈-水溶液为萃取剂，采用ACQUITY UPLC®BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱，柱温为30℃，流动相为乙腈-水，进行梯度洗脱，流速为0.2 mL／min，检测波长为248 nm，对20种烟用香精样品进行测定。欧前胡素的检出限为0.039 5 μg／g，在0.16～8.00 mg／L范围内欧前胡素浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9)。欧前胡素测定结果的相对标准偏差为0.68%～2.97%(n=6)，回收率为90.83%～97.85%。

超高效液相色谱法 烟用香精 欧前胡素

欧前胡素是一种香豆素类化合物，广泛存在于中草药及中成药之中［1-6］，具有抗菌、平喘、抗过敏及解痉镇痛等作用［7］。卷烟中添加烟用香精能够改善卷烟吃味，提高卷烟品质，目前越来越多的天然原料提取香精应用于食品工业和化妆品等日用化工工业中。为了进一步了解烟用香精有必要对其中的欧前胡素进行检测。

目前报道的欧前胡素的检测方法主要为紫外分光光度法［8］、薄层扫描法［9，10］、高效液相色谱法［11-16］、液相色谱-质谱法［17，18］、气相色谱-质谱法［19，20］等。超高效液相色谱法具有灵敏度高、精密度好、分析速度快、重现性好等优点，因此笔者建立了测定烟用香精中欧前胡素的超高效液相色谱法。该法准确、简便、快速，能满足烟用香精的实际检验要求，适合批量烟用香精样品的检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：ACQUITY UPLCTM型，配备真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、恒温柱箱、TUV检测器和色谱工作站，美国Waters公司；

超纯水仪：Millipore RiOs型，美国Millipore公司；

电子分析天平：PG503-S型，感量0.1 mg，瑞士Mettler公司；

超声清洗仪：KQ700DB型，江苏省昆山市超声仪器有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，美国TEDIA公司；

欧前胡素：标准品，99.6%，中国药品生物制品检定所；

冰乙酸：分析纯，99.5%，中国医药集团上海化学试剂有限公司；

20种烟用香精样品：红塔烟草集团；

0.22 μm水系滤膜、0.22 μm有机系滤膜：福建福州蓝龙过滤器材有限公司；

欧前胡素标准储备液：400.00 μg／mL，准确称取0.010 0 g（ 精确至0.000 1 g）欧前胡素标准品，使用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，摇匀；

实验用水为二次石英蒸馏水，经Millipore超纯水仪处理，电阻率不小于18.2 MΩ·cm，使用前经0.22 μm水系滤膜过滤。

1.2 样品前处理

准确称取0.50 g（精确至0.000 1 g）烟用香精样品，置于50 mL锥形瓶中，准确加入10 mL体积比为1∶1的乙腈水溶液，于室温下超声萃取40 min。将萃取液经0.22 μm有机系滤膜过滤后移入2 mL样品瓶，进行超高效液相色谱分析。

1.3 色谱分析条件

色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-水；梯度洗脱条件：0～5.0 min，10%～30%乙腈；5.0～25.0 min，30%～70%乙腈；25.0～28.0 min，70%乙腈；28.0～29.0 min，70%～10% 乙腈；29.0～30.0 min，10%乙腈；流速：0.2 mL／min；检测器：TUV；检测波长：248 nm；柱温：30℃；样品室温度：4℃；进样量：10 μL。

1.4 色谱图

在1.2色谱条件下，对标准样品和烟用香精样品进行分析检测，采用保留时间定性，外标法定量，欧前胡素标准工作溶液色谱图见图1。

图1 欧前胡素标准工作溶液的UPLC色谱图

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

（1）流动相的选择和洗脱梯度的优化

实验中尝试采用不同的流动相进行分离分析，其中包括甲醇-水、乙腈-水、甲醇-冰乙酸水溶液（其中冰乙酸的体积分数分别为0.1%、1%、2%）、乙腈-冰乙酸水溶液（其中冰乙酸的体积分数分别为0.1%、1%、2%）。试验结果表明采用甲醇-水体系作为流动相时，色谱峰有拖尾，峰形不对称；采用乙腈-水体系色谱峰尖锐，峰面积大，峰宽较窄。乙腈-乙酸水溶液与乙腈-水的洗脱效果相当，故选择乙腈-水作为本实验的流动相。

实验中比较了不同梯度洗脱程序，分析结果表明：采用梯度洗脱可以使被测组分得到完全分离，梯度不变改变洗脱的流速发现，流速越大，保留时间越短，峰面积越小，峰高越低；流速越小，保留时间越长，峰面积越大，色谱峰越宽。试验中优化了淋洗液的流速，选择1.3中的梯度洗脱条件，当淋洗液的流速为0.20 mL／min时，欧前胡素的色谱峰尖锐且对称。

（2）检测波长的选择

由于欧前胡素的结构特征使其在252 nm和330 nm波长附近都有紫外吸收。因此，为选择适合欧前胡素的检测波长，分别在 242、246、248、250、254、256、258、260、320、324、326、330 nm 波 长 下 对标准样品进行扫描。分析结果显示，在248 nm波长下欧前胡素的峰形尖锐，有最大峰面积，故选择检测波长为248 nm。

2.2 萃取条件的优化

准确称取一烟用香精样品0.50 g（ 精确至0.000 1 g），分别采用10 mL的甲醇、乙腈，体积比为1∶1的甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-2%冰乙酸水溶液、乙腈-2%冰乙酸水溶液对该样品进行超声萃取，将萃取液分别经0.22 μm水系和有机系滤膜过滤后移入2 mL样品瓶，进行超高效液相色谱分析，结果见表1。结果表明：体积比为1∶1的乙腈水溶液萃取后样品的色谱峰面积最大，色谱峰的峰型尖锐且分离完全，因此实验选取体积比为1∶1的乙腈-水溶液为萃取剂。

表1 不同萃取溶剂的分析结果

准确称取一烟用香精样品0.50 g（ 精确至0.000 1 g），加入10 mL体积比为1∶1的乙腈水溶液，分别超声萃取 10、20、30、40、50、60 min，将萃取液经0.22 μm有机系滤膜过滤后移入2 mL样品瓶，进行超高效液相色谱分析，结果见表2。结果表明：随着萃取时间的不断增加，色谱峰面积先增加后缓慢减小，超声萃取40 min时色谱峰面积最大，因此选择萃取时间为40 min。

表2 不同萃取时间的分析结果

2.3 线性方程

将欧前胡素标准储备液逐级稀释为0.16、0.80、1.60、4.00、8.00 μg／mL 的系列标准工作溶液，按 1.3色谱条件对系列标准工作溶液进行测定，以峰面积y为纵坐标，欧前胡素浓度x为横坐标进行线性回归，得到线性方程及相关系数见表3。

移取0.16 μg／mL的标准溶液2 mL于进样瓶中，平行测定11次，以3倍空白的标准偏差对应值作为方法的检出限，结果见表3。

表3 欧前胡素的线性范围、线性方程和检出限

2.4 精密度及稳定性

准确称取1号、10号、11号烟用香精样品0.50 g（精确至0.000 1 g），平行称取6份，按1.2处理样品，在1.3色谱分析条件下进行分析，结果见表4。由表4可知，1 d内重复进样6次，3种烟用香精样品中欧前胡素测定结果的相对标准偏差分别为0.80%、0.68%、1.36%，说明该分析方法具有较好的重现性；3 d内重复进样6次，欧前胡素测定结果的相对标准偏差分别为2.81%、1.84%、2.97%，说明该方法处理样品中的欧前胡素具有较好的稳定性。

表4 欧前胡素分析方法的精密度及稳定性

2.5 回收试验

在1号和10号烟用香精样品中分别加入高、中、低3个不同量的标准样品。准确称取添加标样后的1号和10号样品0.50 g（精确至0.000 1 g），平行称取3份，在1.3色谱分析条件下进行分析，由本底值、加入量和测定值经计算可得到欧前胡素的回收率，结果见表5。由表5可知，欧前胡素的回收率在90.83%～97.85%之间。

表5 欧前胡素的回收试验结果

2.6 实际样品的测定

准确称取20种烟用香精样品0.50 g（ 精确至0.0001 g）分别按1.2处理样品，在1.3色谱分析条件下进行测定，每个样品平行测定两份，结果见表6。由表6可知，被测的20种烟用香精样品中大部分不含有欧前胡素，4种被测香精中含有欧前胡素，含量在 3.08～24.96 μg／g之间。

表6 20种烟用香精样品测定结果

3 结论

建立了测定烟用香精中欧前胡素的超高效液相色谱法。对20种不同类型的烟用香精进行了检测，结果表明：被测定的20种烟用香精样品中大部分不含有欧前胡素，4种被测香精中含有欧前胡素，含量在3.08～24.96 μg／g之间。该方法简便快速，稳定可靠，重复性好。

［1］贾敏如，王梦月，金曲嫫，等.HPLC测定13种白芷中欧前胡素和异欧前胡素的含量［J］.华西药学杂志，2003，18(5)： 361-362.

［2］李宝国，石俊英.HPLC法测定不同产地北沙参药材中香豆素的含量中药材［J］.中药材，2005，28(6)： 475-476.

［3］郑纯，黄以钟，徐振国.HPLC测定咳必安胶囊及其白云花根中欧前胡素的含量［J］.中国药学杂志，2002，37(10)： 778-781.

［4］孙秀芝，吴艳军，姜慧祯.HPLC法测定活络镇痛片中欧前胡素的含量［J］.齐鲁药事，2008，27(2)： 94-96.

［5］于叶玲，崔久峰，唐星.HPLC法测定温肾咳喘片中欧前胡素、蛇床子素、和厚朴酚、厚朴酚和甘草酸［J］.中草药，2007，38(3)：387-389.

［6］王乃婕，石上梅，杨瑾.HPLC法测定风湿定胶囊中欧前胡素［J］.中草药，2005，36(7)： 1 023-1 024.

［7］王月梦.白芷的古今药用概况及香豆素类成分研究［D］.成都中医药大学，2003：1.

［8］张利，马逾英，蒋桂华，等.白芷新型饮片中总香豆素与欧前胡素的含量测定［J］.时珍国医国药，2011，22(1)： 80-81.

［9］张丽英，任艳春，仲昭庆，等.白芷中欧前胡素的含量测定［J］.中医药信息，2002，19(4)： 24.

［10］陈晓斌，周琴姝，张登山.鼻渊合剂的质量标准［J］.中国药师，2010，13(10)： 1 437-1 439.

［11］陈静，谷铁波，陈贵平.高效液相色谱法测定复方羊角颗粒中欧前胡素的含量［J］.中南药学，2009，7(9)： 673-675.

［12］周志美，耿武松，史学礼，等.HPLC法测定木瓜丸中欧前胡素的含量［J］.安徽中医学院学报，2009，28(6)： 59-60.

［13］杨黎彬，冯锁民，刘少静，等.HPLC法测定止痛透骨膏中欧前胡素的含量［J］.儿科药学杂志，2010，16(4)： 53-55.

［14］何鸽飞，易爱纯，张顺芝.高效液相色谱法测定清眩片中欧前胡素和异欧前胡素的含量［J］.中南药学，2010，8(1)： 30-33.

［15］柯雪红，刘进先，魏刚，等.高效液相色谱法测定苍芷喷鼻液中丹皮酚、欧前胡素的含量［J］.中国药房，2004，15(2)： 109-110.

［16］施芬，吴韶铭，滕云龙.高效液相色谱法测定红药片中欧前胡素含量［J］.中国药业，2008，17(19)： 30.

［17］卢建秋，刘永刚，刘丹，等.LC-MS分析藿香正气水中化学成分［J］.北京中医药大学学报，2006，29(4)： 270-272.

［18］席海为，马强，王超，等.超高效液相串联质谱法同时测定中成药中5-甲氧基补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素和欧前胡素［J］.分析试验室，2010，29(12)： 98-101.

［19］刘红梅，张明贤.白芷中香豆素类成分的超临界流体萃取和GC-MS 分析［J］.中国中药杂志，2004，29(3)： 241-244.

［20］李玲，李祖伦，何宇新，等.川白芷香豆素有效部位的气相色谱-质谱分析［J］.时珍国医国药，2009，20(2)： 306-307.

DETERMINATION OF IMPERATORIN IN TOBACCO FLAVOR BY RP-UPLC

Wang Xueying1，2，Lu Sheming1，Zhu Li1，Meng Zhaoyu1，Cao Qiue2
［1.R&D Center of Hongta Tobacco(Group) Co. Ltd.，Yuxi 653100，China；2.College of Chemical Science and Engineering，Yunnan University，Kunming 650091，China］

A method for determination of imperatorin in tobacco flavor by reversed phase ultra performance liquid chromatography was established. 20 kinds of tobacco flavor samples were extracted by acetonitrile-water (volume ratio of 1∶1),separated at 30℃ on ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm) column and eluted with acetonitrile-water as the mobile phase. Flow rate was 0.2 mL／min and the detection wavelength was 248 nm.The detection limit of imperatorin was 0.039 5 μg／g. The content of imperatorin was linear with the peak area in the range of 0.16-8.00 mg／L(r=0.999 9). The RSD of imperatorin determination results was 0.68%-2.97%, and the average recoveries of imperatorin ranged from 90.83 % to 97.85 %.

UPLC， tobacco flavor， imperatorin

陆舍铭，lushe@ustc.edu

2011-08-26