两种铜(Ⅱ)-司帕沙星配合物与DNA作用及生物毒性比较*

付怀洲,刘向伟,张前前**,李 苓,张栋梅,牛淑妍

(1.中国海洋大学化学化工学院,山东青岛266100;2.青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042)

两种铜(Ⅱ)-司帕沙星配合物与DNA作用及生物毒性比较*

付怀洲1,刘向伟1,张前前1**,李 苓1,张栋梅1,牛淑妍2

(1.中国海洋大学化学化工学院,山东青岛266100;2.青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042)

选择铜(Ⅱ)-司帕沙星-邻菲啰啉Cu(sf)phenCl(sf代表司帕沙星负离子,phen代表邻菲啰啉)和铜(Ⅱ)-司帕沙星Cu(sf)22种配合物,通过电子吸收光谱法、荧光分析法及琼脂糖凝胶电泳法研究了其与DNA的作用,首次以斑马鱼胚胎为模式生物,研究了它们的生物毒性,并对2种配合物的研究结果进行了比较。光谱实验结果表明:Cu(sf)phenCl与DNA的作用强于Cu(sf)2;琼脂糖凝胶电泳实验结果显示:在抗坏血酸存在条件下,Cu(sf)phenCl对pBR322质粒DNA的切割作用更强;同时,斑马鱼胚胎毒性实验显示Cu(sf)phenCl对斑马鱼胚胎毒性也更大。

铜(Ⅱ)-司帕沙星配合物;DNA作用;琼脂糖凝胶电泳;斑马鱼胚胎;生物毒性

喹诺酮类药物是一类合成抗菌药,和其他抗菌药的作用点不同,它们以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶,能有效抑制细菌DNA的复制。近年来,喹诺酮类药物的铜配合物研究相当活跃,如铜(Ⅱ)与西诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星等形成的配合物,以及铜与喹诺酮、邻菲啰啉的混配配合物均有报道[1-6]。司帕沙星(Hsf)属于第三代喹诺酮类药物,具有抗菌谱广、抗菌活性强等优点,Efthimiadou等[7-8]发现司帕沙星的铜配合物Cu(sf)(phen)Cl和Cu(sf)2比司帕沙星具有更好的抗菌活性,且Cu(sf)(phen)Cl能与DNA发生插入作用,具有更强的降低人类白血病细胞HL-60增殖的能力。斑马鱼是理想的毒性评价模型[9-11],斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%,而且作为体内生物活性研究的模式动物,具有试验周期短的优点。另外,斑马鱼胚胎对药物十分敏感,实验毒性指标敏感度均高于成鱼急性毒性实验。本文对Cu(sf)(phen)Cl和Cu(sf)2与DNA作用的电子吸收光谱和荧光光谱进行比较研究,同时研究了其对pBR322质粒DNA的切割作用,并首次尝试将斑马鱼胚胎作为生物模型应用于金属配合物的生物毒性研究,旨在为高效低毒药物研发提供理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器试剂与材料

岛津UV-2550型紫外-可见分光光度计;日立F-4600型荧光光谱仪;北京六一DDY-8C型电泳仪及WD-9413B凝胶成像分析仪。

鲑鱼精DNA(生化试剂,sigma公司),其纯度用UV谱检测,A260/A280>1.8,浓度用260 nm处的摩尔消光值检测(ε=6 600 mol-1·cm-1);溴化乙锭EB(生化试剂,美国Am resco公司);pBR322质粒DNA(生化试剂,广州东盛生物科技有限公司);琼脂糖(生化试剂,西班牙原装,基因科技有限公司分装);6×loading buffer(生化试剂,sigma公司);Gold View(生化试剂,sigma公司);抗坏血酸(分析纯,sigma公司);司帕沙星(分析纯,北京莱瑞森医药科技有限公司);三(羟甲基)氨基甲烷以及其它试剂均为国产分析纯。

Tris-NaCl缓冲液(p H=7.40,p H=7.60);SBA电泳液(45 mmol·L-1硼酸,1 mmo l·L-1氢氧化钠,p H=8.45);分析实验用水为二次水。

2种配合物(配合物1为Cu(sf)phenCl,配合物2为Cu(sf)2)按照文献[7-8]合成,通过红外光谱、元素分析、差热-热重分析对配合物进行表征,结果与文献一致。

斑马鱼购于青岛南山花卉市场,饲养斑马鱼的水是充氧饱和、温度保持恒定(25±1)℃的自来水。

1.2 配合物对DNA作用的紫外光谱

在p H=7.40的Tris-NaCl缓冲液中加入8.86×10-3mol·L-1DNA及不同浓度的配合物溶液,以相应浓度的配合物溶液为参比,测量其紫外吸收光谱,波长范围为190～360 nm。根据文献[12]计算减色率:H=(A0-Ab)/A0,其中A0和Ab分别为未加配合物和加入配合物的DNA溶液的吸光度。类似地,用相应的方法进行DNA对铜-司帕沙星配合物紫外光谱的影响的实验。

1.3 配合物对EB-DNA体系作用的荧光光谱

在p H=7.40的Tris-NaCl缓冲液中分别加入一系列不同浓度的配合物、1.7×10-5mol·L-1DNA和1×10-5mol·L-1EB,测量该体系在550～660 nm范围内的发射荧光光谱,激发波长为525 nm,激发发射狭缝宽均为5 nm,发射光谱扫描速度15 nm·s-1。

1.4 琼脂糖凝胶电泳

将125 ng质粒pBR322 DNA与不同浓度的配合物以及50倍于配合物浓度的还原剂抗坏血酸混合,然后用p H=7.60的Tris-NaCl缓冲液定容至5μL,反应温度37℃,待反应时间分别为10和40 min时,用2～3μL的6×loading buffer终止反应。在0.8%琼脂糖凝胶和SBA电泳液(p H=8.45)中电泳一定时间(电压为220 V),以2～3μL的Gold View作为凝胶着色剂,用凝胶成像分析仪观察并拍照电泳结果。

1.5 斑马鱼胚胎的孵化

斑马鱼在(25±1)℃、光暗比为14 h∶10 h实验室中培养。实验前1天将一定数量的成年斑马鱼按雌、雄1∶1混养于产卵缸中,放于暗室,次日早晨取出,斑马鱼见光产卵。收卵,清洗去除杂物和死卵。

1.6 配合物对斑马鱼胚胎的毒性实验

将一定浓度的配合物溶液2 m L依次加入24孔板细胞培养板中,每个浓度做8个平行,放入温度(27～28)℃的恒温水浴中,取目测健康的5 hpf(hours post fertilization)囊胚期斑马鱼胚胎,每孔放5粒,以溶剂空白做对照。每隔2 h去除死的斑马鱼胚胎。在体式显微镜下观察记录24和72 hpf时的胚胎死亡数及72 hpf的胚胎孵化数。

2 结果与讨论

2.1 配合物与DNA作用的紫外光谱分析

DNA的碱基及磷酸氧是许多药物的作用位点,与药物作用后往往会导致其特征峰发生位移和峰强度的变化,通常情况下DNA与化合物发生了作用大多数会在电子吸收光谱有所表现,据此可粗略判断化合物是否与DNA发生了作用[12]。如图1所示,在分别加入配合物1和配合物2后,DNA的吸收峰位置发生移动,吸收强度降低,配合物浓度增大,减色效应逐渐增大。其中在201 nm处的吸收峰分别红移2、1 nm,峰位置移动较小,减色率分别为40.1%、36.1%。在258 nm处的吸收峰分别紫移2、1 nm,减色率分别是40.8%、27.0%。比较金属配合物溶液中加入DNA前后的电子吸收光谱,如果加入DNA后吸收峰红移、吸光度减小,则表明配合物与DNA发生了插入作用[13]。由图2所示,因配体不同,配合物1的紫外光谱与配合物2的明显不同,在分别加入不同浓度的DNA后,配合物的电子吸收光谱峰强度减弱,峰位置发生了红移,且由减色率可以看出配合物1中电子吸收光谱变化比配合物2大(请注意图2中配合物2的纵坐标远小于配合物1的),可初步判断配合物1与DNA之间的插入作用较强[12-13]。

图1 铜-司帕沙星配合物对DNA紫外光谱的影响Fig.1 Effect of comp lexes on the electronic absorption spectra of DNA

图2 DNA对铜-司帕沙星配合物紫外光谱的影响Fig.2 Effect of DNA on the electronic abso rp tion spectra of comp lexes

2.2 配合物对EB-DNA体系荧光光谱分析

EB是1种荧光染料,它本身荧光极弱,与双链DNA发生嵌插作用后,荧光吸收峰的荧光强度大大增强。当EB与DNA发生作用的配合物共存时,可能发生竞争反应,从而影响EB与DNA的相互作用,使得DNA-EB体系的荧光光谱发生变化,因而EB可作为配合物与DNA作用的结构探针[15]。配合物1加入EB-DNA体系后,随着配合物浓度的增大,EB-DNA体系的荧光逐步猝灭(见图3),由此可以认为配合物分子将部分EB从EB-DNA复合物中挤出,发生插入作用[7]。不同浓度配合物2加入EB-DNA体系,对体系荧光光谱影响不明显,说明配合物2与DNA之间存在比较弱的插入作用。这是因为插入方式要求配合物的插入配体具有较好的平面性、适中的平面面积和疏水性[13-14],而配合物2中的1个司帕沙星配体被邻菲罗啉取代后得到的配合物1的结构更符合此要求。

图3 配合物浓度对EB-DNA体系的荧光强度的影响Fig.3 Fluorescence spectra of EB-DNA system under different concentrations of comp lex 1 and comp lex 2

2.3 配合物对DNA的切割作用

完整的pBR322质粒DNA通常呈共价闭环的超螺旋型(FormⅠ),当其中1条链上出现1个切口(即单链断裂)时就变成开环缺刻型(Fo rmⅡ),当2条链在同一位置都发生断裂时就变为线型(FormⅢ)。pBR322 DNA的3种形式在电泳上有完全不同的迁移率,FormⅠ最快,Fo rmⅢ次之,Fo rmⅡ最慢,以此可研究物质对DNA的断裂作用[16]。如图4所示,在p H为7.60,温度为37℃的条件下,以抗坏血酸做还原剂时(浓度为配合物的50倍),2种铜-司帕沙星配合物均可以将共价闭环的超螺旋构型(FormⅠ)的pBR322质粒DNA切割成开环缺刻构型(FormⅡ),配合物1还切割出线型(Fo rmⅢ),而且随着配合物浓度的增大,对DNA的切割活性显著增强。从作用时间来看,作用10 min时,配合物1已经对pBR322 DNA有显著作用,而配合物2对pBR322质粒DNA未表现出显著切割作用;作用时间40 min时,当配合物1浓度大于2.5μmol·L-1时,将Ⅰ型DNA全部转变为Ⅱ型DNA,配合物1浓度为40μmol·L-1时将Ⅰ型DNA转变为Ⅱ型和Ⅲ型,而配合物2只是将Ⅰ型DNA部分转变为Ⅱ型,但没有切割出Ⅲ型。可见配合物1对DNA的切割活性比配合物2更强。

图4 37℃,在10 mmol·L-1 Tris-NaCl/1 mmol·L-1 EDTA(p H=7.60)缓冲溶液中,在抗坏血酸(浓度为配合物浓度的50倍)存在下配合物浓度对pBR322 DNA(125 ng)切割活性的影响Fig.4 Agarose gel eletropho resis patterns fo r the cleavage of pBR322 p lasmid DNA by two comp lexes.Conditions:0.025μg·L-1 DNA;50 fold asco rbic acid;10 mmol·L-1 Tris-NaCl/1 mmol·L-1 EDTA buffer,p H=7.60;at 37℃

2.4 配合物对斑马鱼胚胎的作用

斑马鱼胚胎发育分6个时期:卵裂期,囊胚期,原肠胚期,分裂期,成形期,孵化期[17]。其中囊胚期是细胞高度分裂期,在作用物质的压力下可能使胚胎在进入外包期前就停止发育,并伴随着胚盘细胞的损毁和卵凝结[18],选择5hpf囊胚期作为作用的开始点,还可以从一定程度上避免受精过程的不确定性或孤雌生殖[19]。成形期和孵化期是胚胎发育的后期,在发育毒理学上有特殊意义。为了比较配合物的生物毒性,本实验选择配合物对斑马鱼胚胎在成形期24 hpf时的致死率和孵化期72 hpf时的半数致死浓度和孵化率作为评价为指标。由图5(a)可以看出,配合物1对斑马鱼胚胎24 hpf的死亡率的影响作用高于配合物2。对斑马鱼胚胎在72 hpf时孵化率影响如图5(b)所示,随着配合物浓度增大,孵化率迅速降低,两者在72 hpf时对胚胎孵化率影响大小为配合物1>配合物2,配合物对斑马鱼胚胎的半数致死浓度分别是15.3 mg·L-1,18.6 mg·L-1。综上可见2种配合物对斑马鱼胚胎毒性作用顺序为:配合物1>配合物2,说明配合物中1个司帕沙星换成邻菲啰啉后,与DNA作用增强的同时,配合物的生物毒性也有所增强。以上结果与荧光光谱的数据一致,表明配合物的生物毒性与配合物与DNA分子之间的插入作用存在一定程度的关联。

图5 配合物浓度对斑马鱼胚胎影响Fig.5 Effect of different concentrations of the two comp lexes on zebrafish embryos

3 结语

通过比较Cu(sf)phenCl和Cu(sf)2与鲑鱼精DNA结合作用及其对pBR322质粒DNA的切割作用,证实Cu(sf)phenCl对DNA具有更强的活性,对斑马鱼胚胎的毒性也更大。因此,若作为潜在的药物,需进一步考察其药物毒性。

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Comparisons of DNA Binding and Biotoxicity of Two Cu(Ⅱ)-Sparfloxacin Complexes

FU Huai-Zhou1,L IU Xiang-Wei1,ZHANG Qian-Qian1,L ILing1,ZHANG Dong-M ei1,N IU Shu-Yan2
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266100,China;2.College of Chemistry and Molecular Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

The interactions of two Cu(Ⅱ)-sparfloxacin comp lexes Cu(sf)phenCl and Cu(sf)2(sf refers to sparfloxacin anion)with DNA were investigated by electric absorp tion spectroscopy,fluorescence spectroscopy and gel electrophoresismeasurements.For the first time,the biotoxicity of the comp lexeson zebrafish embryoswas determined,and the resultswere compared.The spectroscopic studies indicated that the binding ability of the complex Cu(sf)phenCl was greater than that of Cu(sf)2,and gel eletrophoresis revealed that its cleavage activity(cleave pBR322 DNA in the presence of ascorbic acid as a reducing regent)was greater too.In the meantime,the bio toxicity of the comp lex Cu(sf)phenCl on zebrafish em bryoswas also greater than that of Cu(sf)2.

Cu-sparfloxacin comp lex;DNA binding;gel electrophoresis measurements;zebrafish embryo;bio toxicity

O614.2

A

1672-5174(2011)7/8-144-05

国家自然科学基金项目(21075073);中国海洋大学实验室研究基金项目(SYS200905)资助

2010-10-10;

2011-05-18

付怀洲(1986-),男,硕士生。E-mail:fuhuaizhou@163.com

**通讯作者:E-mail:qqzhang@ouc.edu.cn

责任编辑 徐 环