胱硫醚β－合成酶基因rs719037、rs719038多态性与新疆哈萨克族原发性高血压的相关性研究

钟 华，张春军，赵 丹，石晓鹏，杨建峰，何 芳

（1新疆地方病与民族高发病实验室，石河子832002；2石河子大学医学院病理生理教研室，石河子832002；3郧阳医学院生理学教研室，十堰442000）

胱硫醚β－合成酶基因rs719037、rs719038多态性与新疆哈萨克族原发性高血压的相关性研究

钟 华1，2，张春军1，2，赵 丹3，石晓鹏1，杨建峰1，何 芳1，2

（1新疆地方病与民族高发病实验室，石河子832002；2石河子大学医学院病理生理教研室，石河子832002；3郧阳医学院生理学教研室，十堰442000）

研究新疆哈萨克族原发性高血压（EH）患者胱硫醚β－合成酶（CBS）基因多态性与EH的关系。采用整群抽取随机抽样的方式，以新疆沙湾县733名哈萨克族人（EH组366人，对照组367人）为研究对象，进行流行病学调查和临床检查，并采集血样，采用SnaPshot技术进行基因分型。结果显示：CBS rs719037基因型及等位基因在EH组和对照组分布差异无显著性（P＞0.05）；CBS rs719038基因型及等位基因在EH组和对照组分布差异无显著性（P＞0.05）。结论 新疆哈萨克族人群中存在CBS基因rs719038、rs719037多态性位点。同时rs719038、rs719037位点与EH缺乏关联。

CBS；基因多态性；高血压；新疆哈萨克族

心血管疾病是危害各国人民健康的主要疾病，其发病率在我国呈逐年升高趋势，已成为我国慢性非传染性疾病的防治重点，其中原发性高血压（essential hypertension，EH）是最常见的心血管疾病之一。国际卫生组织（World Health Or ganization，WHO）于1978年公布的澳大利亚、日本、新西兰、美国高血压发病率为8%～18%。我国15岁以上人群高血压患病率在1959年、1979年、1991年分别是5.11%、7.73%1、11.88%，呈逐年升高的趋势［1－2］。1991年我国的高血压普查，15岁及以上人口中高血压患病率为患病人数9000万人，其中新疆哈萨克族和汉族的高血压患病率分别为18.97%、13.88%，哈萨克族明显高于汉族，且均高于我国平均发病率11.88%［1－3］。2006年度全国健康状况普查结果显示，西部人的健康状况不如东部，新疆人的健康状况在2006年的全国健康状况普查中排列在倒数第一。1991年、1999年、2004年、2007年流行病学调查显示：哈萨克族高血压患病率分别是18.97%、32.8%、40.5%、52.39%，呈逐年升高的趋势［2－4］，历次高血压流行病学调查资料均显示：新疆哈萨克族人群是高血压病的易感人群，是我国高血压患病率较高的民族之一，居全国各民族的前5位［3］，有着鲜明的民族聚集和高发的特征。

胱 硫 醚 β－合 成 酶 （cystat hionineβ－synthase，CBS）是一种吡哆醛磷酸依赖性酶，其催化同型半胱氨酸与丝氨酸缩合成胱硫醚。CBS作为同型半胱氨酸代谢途径中的关键酶之一，当其缺陷时可导致高同型半胱氨酸血症。近年来，血浆同型半胱氨酸（ho mocysteine，HCY）增加作为EH的危险因子越来越受到重视［5］，研究发现血浆HCY水平升高与EH有着密切的联系。

本研究采用多重单碱基延伸反应（SNaPshot）技术对CBS基因的单核苷酸多态性（SNP）位点进行分析，以探讨哈萨克族CBS基因多态性与EH的关联，旨在为个体风险的评价提供可行的手段，为哈萨克族族EH的防治提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

在新疆沙湾县博尔通古乡流行病学调查基础上，选择年龄18岁以上72岁以下，至少三代在本地居住的哈萨克族居民，非一、二级亲属，无血缘关系，无异族通婚史。

病例组纳入标准：根据1999年 WHO／SIO诊断标准，收缩压≥140 mm Hg和（或）舒张压≥90 mmHg，常规检查排除继发性高血压、心肌梗死、过量饮酒、服用避孕药史，无糖尿病、甲状腺及肝肾疾病史等。

本次调查EH组366例（男性159人，女性207人，平均年54岁），对照组367名 （男性160人，女性207人，平均年龄51岁）。

1.2 方法

1.2.1 调查方法

患者在3个不同时间安静状态下测量血压值的平均值，收缩压≥140 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 k Pa）和（或）舒张压≥90 mmHg为高血压；收缩压＜140 mm Hg和舒张压＜90 mm Hg，无服用降压药史、高血压家族史及其他器质性心脏病史等为健康对照。采用整群抽取随机抽样法，抽取博尔通古乡居民，由统一培训的调查员入户进行问卷调查和检测。包括吸烟、饮酒、食盐量、膳食情况、家族史、高血压史、血压、身高、体重、腰围、臀围测量及生化指标检测等。

1.2.2 标本采集

待检者均禁食12 h，于次日清晨空腹抽取肘静脉血6 mL，置乙二胺四乙酸（EDTA）于抗凝管中，2500 r／min离心5 min，取血清，置－20℃保存，用于血脂、血糖等常规生化检测（当日测定）。

1.2.3 基因组DNA提取

全血采用酚－氯法提取DNA。

1.2.4 CBS基因片段扩增

设计PCR引物用于扩增包含SNP位点的片段，及紧邻SNP位点的延伸引物用于单碱基延伸。检索美国国立生物技术信息中心（NCBI）公共数据库中SNP位点序列，用Pri mier3软件设计PCR引物及延伸引物。引物如下：

上游：5′－TCTGTGTGTCTGGCCTTATGGTG－3′；

下游：5′－CGTGCTGGGATCCAATAAGCTC－3′。

PCR反应体系：10×buffer 2.0μL，25 mm Mg Cl21.2μL，d NTP 0.6μL，多重PCR引物2.0μL，Hotstar Taq聚合酶0.2μL，DNA模板1.0μL，去离子水11.0μL，总体系20.0μL。

1.2.5 CBS基因片段的多态性检测

用SNaPshot分型技术进行t SNP位点分型。PCR产物延伸反应即单碱基延伸反应。rs719037单碱基延伸引物序列如下：

5′－GATCCTACAGCTTTGTTCTTTTACAAT－3′。

rs719037单碱基延伸引物序列如下：

5′－ATGATGTATCCTGATGTATTTGTCC－TT－3′。

延伸反应体系（10μL）包括5.0μL SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2.0μL纯化后PCR产物，1.0μL延伸引物，2.0μL超纯水。PCR循环程序：96℃预变性1 min；28循环×（96℃ 变性30 s，50℃退火5 s，60℃延伸30 s）；60℃延伸1 min；4℃保存。延伸产物纯化，在10.0μL延伸产物中加入1 U SAP酶，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。最后延伸产物置3130XL（ABI）测序仪上，取0.5μL纯化后的延伸产物，与0.5μL Liz120 SIZE STANDARD，9.0μL Hi－Di混匀，95℃变性5 min后上ABI3130XL测序仪。

在测序仪上收集的原始数据集原始数据，用Gene Mapper 4.0软件 （美国 Applied Biosystems有限公司）进行分析，以及判断结果是否成功。

1）由于生产力的发展，工业的不断进步，或者产品的更新换代，他们的就业岗位是不断变化的，需要高职生具有很强的适用能力来快速满足换岗要求。因此，要用动态的眼光来研究他们的就业岗位，传统的一个人在一个岗位静态工作几十年的状态将不复存在。

1.2.6 统计学分析

用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。计算两组基因型频率以确认是否符合Har dy－Weinberg遗传平衡。

计数资料组间比较采用χ2检验，由基因型频率计算等位基因频率，组间等位基因频率和基因频率比较采用χ2检验。

2 结果与分析

2.1 新疆哈萨克族EH组与对照组的临床相关指标比较

由表1可知：各组的收缩压、舒张压、平均动脉压、体重指数、空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白的平均水平两组间均有差异（P＜0.05），EH组均高于对照组；其余指标两组间无差异（P＞0.05）。

表1 新疆哈萨克族EH组与对照组的临床相关指标比较Tab.1 Clinical paraments of essemtial hypertension in the Kazakh and control subjects

2.2 哈萨克族CBS基因t SNP及单碱基延伸电泳峰型

结果见图1～3。

图1中橙色峰为SIZE STANDARD，蓝色、绿色、红色、黑色峰分别代表延伸加入dd GTP、dd ATP、dd TTP和dd CTP的延伸产物，峰下面标注的等位基因。

图2为rs719037位点单碱基延伸图。根据测序图的单峰、双峰来判断基因型，单峰为纯合基因型，双峰为杂合基因型。

图1 新疆哈萨克族不同SNP单碱基延伸电泳峰型Fig.1 SNP shot electropherogram result of SNPs in Kazakh groups

图2 rs719037位点单碱基延伸电泳峰型Fig.2 SNP shot electropherogram result of rs719037

图3 rs719038位点单碱基延伸电泳峰型Fig.3 SNP shot electropherogram result of rs719038

2.3 CBS基因型及等位基因在新疆哈萨克族EH组与对照组中的分布及患病风险估计

2.3.1 新疆哈萨克族rs719037位点基因型及等位基因分布

结果见表2。

由表2可见：rs719037位点基因型分布符合Har dy－Weinber g遗传平衡（P＞0.05），提示该人群有较好的代表性；rs719037位点基因型及等位基因在EH组与对照组间无差异。

表2 新疆哈萨克族rs719037位点基因型及等位基因分布Tab.2 Distribution of the genotypes and alleles of rs719037 in the Kazakh group

2.3.2 rs719038多态性基因型及等位基因分布

结果见表3。

由表3可见，rs719038位点基因型分布符合Har dy－Weinberg遗传平衡（P＞0.05），提示该人群有较好的代表性。表3中，rs719038位点基因型及等位基因在EH组与对照组间无差异。

表3 新疆哈萨克族rs719038位点基因型及等位基因分布Tab.3 Distribution of the genotypes and alleles of rs719038 in the Kazakh group

3 讨论

原发性高血压是最常见的心血管疾病之一，已成为我国慢性非传染性疾病的防治重点。目前EH的病因尚不完全清楚，可能是一类有多基因和环境因素共同影响导致的复杂遗传性疾病。新疆历次高血压流行病学调查资料均显示：新疆哈萨克族是高血压的易感人群［2－4］，提示新疆哈萨克族可能具有不同的遗传和环境背景。其确切的发病机制尤其是哈萨克族EH高发的分子遗传机制有待进一步阐明。

该民族人群是一个相对隔离群体，影响血压的环境因素，如生存环境、饮食习惯（高盐，高动物脂肪摄入），生活方式和精神压力等均较为一致，一定程度地减少了遗传异质性的影响；受当地医疗条件的限制，绝大多数EH患者均未经服药治疗，故所测血压能客观地反映人群的实际血压水平，这些都减少了影响统计结果的混杂因素，新疆哈萨克族是进行高血压分子流行病学研究的理想人群。

人类胱硫醚β－合成酶是一种吡哆醛磷酸依赖性酶，以63 k Da的同源四聚体形式存在，它催化同型半胱氨酸与丝氨酸缩合成胱硫醚。CBS作为同型半胱氨酸代谢途径中的关键酶之一，CBS基因突变可能影响CBS亚单位与血红素和5′－磷酸吡哆醇的相互作用，从而使酶活性降低，导致高HCY血症。高HCY血症是一种独立的危险因素，血浆HCY水平与心脑血管事件的发生率呈显著的正相关［6－8］。高HCY可通过多种机制损伤血管内皮，导致靶器官的损害。CBS基因错义突变是引起CBS缺乏或活性下降的主要机制。一旦CBS基因突变引起酶活性改变，必然导致HCY降解受阻，造成HCY在血液中蓄积而产生高同型半胱氨血症。目前，越来越多的研究表明，胱硫醚合成酶基因多态性与心脑血管疾病和出生缺陷如神经血管畸形的发生有关［9－11］。

CBS基因多态性及与不同疾病关系具有种族、民族及地域间的差异，有关CBS基因多态性与新疆哈萨克族高血压的相关性研究未见报道。利用聚合酶链反应－限制片长多态性（PCR－RFLP）等技术研究发现，CBS基因中的基因多态位点至少有80个，不同的多态位点对CBS活性的影响不尽相同［12－14］。我们从人类基因库中选取杂合突变频率高的CBS基因位点rs719037、rs719038进行研究。

首先在分析EH发生的危险因素后发现，超重、肥胖是新疆哈萨克族的危险因素，说明脂肪在EH的发病过程中起重要作用，在新疆哈萨克族表现尤为明显，这与哈萨克族膳食结构中动物脂肪摄入较多有关。已有研究表明，血脂代谢异常（主要是指血浆中甘油三酯和总胆固醇以及低密度脂蛋白的浓度升高）是动脉粥样硬化的主要危险因素之一。本研究的结果显示哈萨克族EH人群中血浆总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白较对照组明显增高。上述研究结果提示：环境因素在哈萨克族EH高发的机制中可能占有重要地位，其中超重、肥胖、腹部肥胖、血脂代谢紊乱、蔬菜摄入不足是新疆哈萨克族EH危险因素。因此，控制体重、降低血脂，改善饮食习惯和不良生活行为有助于预防新疆哈萨克族EH的发生。

本研究发现在新疆哈萨克族EH组CBS基因rs719037位点存在GG、GA和AA三种基因型，频率分别为14.2%、44.3%、41.5%，等位基因 G 和 A频率分别为36.3%和63.7%：在对照组同样检测到GG、GA和AA三种基因型和G、A两种等位基因，AA、AG和GG三种基因型的频率分别为12%、51.2%和36.8%，G和A两种等位基因频率分别为27.6%和62.4%。两组基因型和等位基因频率分布无统计学差别；EH组CBS基因rs719038位点存在CC、CT和TT三种基因型，频率分别为24.9%、48.6%、26.5%和，等位基因C和T频率分别为49.2%和50.8%：在对照组同样检测到CC、CT和TT三种基因型和C、T两种等位基因，CC、CT和TT三种基因型的频率分别为22.1%、54.5%和23.4%，C和 T两种等位基因频率分别为49.3%和50.7%。两组基因型和等位基因频率分布无统计学差别。以上的研究结果提示rs719037、rs719038多态性可能与新疆哈萨克族EH不相关。

新疆哈萨克族EH组和对照组CBS基因rs719037、rs719038位点基因型和等位基因频率无差异可能和样本量不够大提供的信息量有限有关，并且EH是一多基因复杂性疾病，在多基因复杂性疾病研究中，由多个变异位点组合构成的单倍型分析蕴含较单个位点更大的信息量，以单倍型为基础进行的分析所得出的结论将明显优于单核苷酸多态性的分析。另外，单个基因的变异不足以引起疾病，需要多个基因的联合作用（协同效应），在环境因素的参与下，个体才会发病。因此我们在下一步的研究中将扩大样本量并进行多个相关基因多态性的分析，找出遗传易感性的单倍体形式，联合多种相关基因表达的血浆水平及相关酶催化效率来探讨EH等相关性心血管疾病的发病机制。如果能够阐明基因多态性与疾病之间的关系，就可通过基因检测筛检易感人群，为疾病的一级预防提供可行的手段，为个体危险度的评价提供重要的方法。

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Association bet ween CBS Gene Poly morphisms and Essential Hypertension in the Kazakh of Xinjiang

ZHONG Hua1，2，ZJANG Cunjun1，2，ZHAO Dan3，SHI Xiaopeng1，YANG Jianfeng1，HE Fang1，2
（1 Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases，Shihezi 832002，China；2 Depart ment of Pathophysiology，Medical College，Shihezi University，Shihezi 832002，China；3 Depart ment of Physiology，Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China）

We investigate the relationship bet ween gene poly morphis ms in the cystathionineβ－synthase（CBS）with essential hypertension（EH）in the Kazakh population.Based on the case－control study，we selected 733 （366 EH，367 controls）Kazakh fro m the Boertonggu countryside of Shawan region in Xinjiang Uygur Autono mous Region of China by rando m cluster sampling.After questinnaires and physical examinations，we collected blood.The poly morphisms of CBS in the studygrops were detected with SnaPshot assays.The results showed the frequencies of genotypes and alleles of rs719037 had no differences between EH and contrl group（P＞0.05）；there was no difference in the genotypes and alleles of rs719038 bet ween EH and contrl group.（P＞0.05）.The conclusions was that there were poly mor phis ms at rs719038 and rs719037 of CBS gene，but there was a lack of associated with EH in the Kazakh of Xinjiang.

cystathionineβ－synthase；gene poly mor phis ms；hypertension；the Kazakh of Xinjiang

R544.1

A

1007－7383（2011）06－0716－06

2011－09－20

国家自然科学基金项目（30760077），新疆兵团重点领域科技攻关项目（2011BA059）

钟华（1973－），女，讲师，从事心血管病理生理学研究；e－mail：7151zhhua＠sohu.co m。

何芳（1964－），女，教授，硕士导师，从事心血管病理生理学研究；e－mail：fangf2002shz＠126.com。