上、下坡跑台运动对去卵巢小鼠骨组织IL-6、TNF-α和TRAP基因表达的影响

马 涛，季 浏，李世昌，孙 朋

上、下坡跑台运动对去卵巢小鼠骨组织IL-6、TNF-α和TRAP基因表达的影响

马 涛，季 浏，李世昌，孙 朋

目的：以去卵巢手术小鼠模拟妇女绝经后骨质疏松症状，对比研究上、下坡跑台运动对去卵巢小鼠骨组织IL-6、TNF-α和TRAP等细胞因子的影响。方法：32只8周龄C57 BL/6雌性小鼠随机分为4组：假手术安静组（SHAM），去卵巢安静组（OVX），去卵巢上坡跑组（OVX+UP），去卵巢下坡跑组（OVX+DOWN）。SHAM组小实行去卵巢假手术，其余3组小鼠均摘除卵巢。训练方案为：OVX+UP组进行上坡跑训练，而OVX+DOWN组进行下坡跑训练，每次40 min，每周训练5次，共训练8周。8周后取右侧股骨提取mRNA，检测其骨组织IL-6、TNF-α和TRAP等细胞因子的基因表达。结果：与SHAM组相比，OVX组小鼠骨组织IL-6、TNF-α和TRAP的基因表达显著增加；两运动组小鼠骨组织IL-6、TNF-α和TRAP的基因表达比OVX组小鼠显著降低，且OVX+DOWN组比OVX+UP组的效果更明显。结论：跑台运动通过抑制去卵巢小鼠骨组织破骨细胞的分化和活化，从而有效预防骨质疏松症的发生，且下坡跑运动比上坡跑运动效果更明显；跑台运动对去卵巢小鼠破骨细胞分化和活化的抑制作用可能与骨组织IL-6和TNF-α等细胞因子基因表达的变化有关。

跑台运动；去卵巢小鼠；IL-6；TNF-α；TRAP

骨组织是一个不断自我更新的组织，通过自我更新，骨组织可完成移除废旧的骨组织、修复有创伤的部位以及适应变化的力学载荷等功能。骨组织的自我更新有赖于成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）进行骨形成和骨吸收。当骨形成大于骨吸收时则骨量增加，而当骨吸收大于骨形成时则骨量减少。在某些病理状态下，成骨细胞或破骨细胞数量异常及功能紊乱，则发生骨量过分增加或减少的疾病，如骨形成功能亢进的骨硬化症和骨吸收功能亢进的骨质疏松症等。妇女绝经后骨质疏松症就是由于绝经后雌激素的迅速下降引起的破骨细胞大量生成及活化导致的。破骨细胞来源于骨髓造血干细胞，在某些因素的刺激下，造血干细胞可向巨噬细胞分化、融合并最终形成破骨细胞。近年来的大量研究表明[1－2]，除了各种激素的作用之外，骨组织及骨髓局部的细胞因子对破骨细胞的分化及功能发挥具有重要作用。特别是近年来关于OPG－RANKL－RANK系统的研究更是将成骨细胞与破骨细胞之间的通讯之谜逐步揭开。骨组织及骨髓中成骨细胞、基质细胞、骨细胞及巨噬细胞等分泌的IL－6和TNF－α等细胞因子，可通过OPG－RANKL－RANK系统依赖及非依赖途径促进破骨细胞的增值、分化及骨吸收功能的发挥。本研究利用去卵巢小鼠模型模拟妇女绝经后骨质疏松症状，通过对骨组织破骨细胞标志性酶抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的检测，对比研究上、下坡跑台运动对破骨细胞分化和活化的影响，并探讨IL－6和TNF－α等细胞因子在绝经后破骨细胞分化过程中的作用及运动对它们的影响，对于深入揭示绝经后骨质疏松的发病机制及运动干预措施的选择将具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级C57BL/6雌性小鼠32只，约8周龄，体重（20．26±2．13）g，（由上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供）。动物购回后在本实验中心动物房适应性喂养一周，然后随机分为4组，即假手术安静组（SHAM），去卵巢安静组（OVX），去卵巢上坡跑组（OVX+UP），去卵巢下坡跑组（OVX+DOWN），每组8只。

1.2 去卵巢手术

动物以1%戊巴比妥钠（0．1 g/kg）经腹腔麻醉后，剪除长毛，分别在脊柱两侧切开背肌1 cm切口，SHAM组小鼠行去卵巢假手术，仅去除卵巢周围少量脂肪组织，其余3组小鼠均摘除卵巢，用可吸收的羊肠线缝合伤口，在伤口外涂少量红霉素软膏。

1.3 运动方案

SHAM组和OVX组在笼中正常饲养，没有进行任何训练；OVX+UP组和OVX+DOWN组于去卵巢手术后7天开始进行上坡跑或下坡跑训练，训练方案见表1。

表1 运动组小鼠训练方案Tab.1 Training program of Exercise group

1.4 取材

于运动组小鼠最后一次训练结束24h后，去眼球取血处死小鼠。取其右侧股骨置于液氮中速冻，放于－80℃冰箱保存，待提RNA。

1.5 Real time PCR法测定骨组织IL-6、TNF-α和TRAP的基因表达

常规方法提取股骨总RNA，逆转录。根据所要检测的目的基因，在NCBI数据库查询各基因引物序列，由上海生工生物技术有限公司进行引物合成，各基因引物序列及扩增长度为：IL－6：F 5′－GAACTCCCTCTCCACAAGC－3′，R 5′－TTCTTGTCAAGC AGGTCTCC－3′，扩增长度 325 bp；TNF－α：F 5′－GAGTCCGGGCA GGTCTACTTT－3′，R 5′－CAGGTCACTGTCCCAGCATCT－3′，扩增长度 235 bp；TRAP：F 5′－ TGA CAA GAG GTT CCA GGA －3′，R 5′－ AGC CAG GAC AGC TGA GTG －3′，扩增长度 312 bp；β－actin：F 5′－CAATTCCATCATGAAGTGTGAC－3′，R 5′－CCACA CAGAGTACTTGCGCTC－3′，扩增长度 184 bp。荧光定量 PCR 扩增反应按照以下体系进行，SYBR Premix Ex Taq TM（2×）10 μL、PCR Forward Primer（10 μm）0．4 μL、PCR Reverse Primer（10 μm）0．4 μL、ROX Reference Dye（50×）0．4 μL、DNA 模板 2 μL、加DEPC水使总反应体系达到20 μL。Real time PCR分3阶段，扩增采用3步法进行，温度循环参数如下：Stage 1（1×）：95 ℃，1 min（预变性）。Stage 2（40×）：95 ℃，15 s；61 ℃，30 s；72℃，45 s（收集荧光）。Stage3（1×）：建立 PCR 产物的熔解曲线，95℃，30 s；61℃，2 min；95℃，15 s；每 1℃收集荧光。反应结束后，PCR仪给出各反应孔的Ct值，以β－actin基因为内参，根据公式2－ΔCt计算各基因的相对表达量。

1.6 统计学方法

2 实验结果

从图1、图2和图3可以看出，OVX组小鼠骨组织IL－6、TNF－α和TRAP mRNA相对表达量显著高于SHAM组小鼠（P＜0．01）；两运动组小鼠骨组织 IL－6 、TNF－α 和 TRAP mRNA 相对表达量比 OVX组小鼠显著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）；而两运动组相比较，则OVX+DOWN组小鼠骨组织IL－6、TNF－α和TRAP mRNA相对表达量比 OVX+UP 组小鼠显著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。

图1 IL-6 mRNA的相对表达量Fig.1 The mRNA relative expression of IL-6注： **P＜0．01，代表与 SHAM 组比较；#P＜0．05 和 ##P＜0．01，代表与 OVX组比较；△P＜0．05 和△△P＜0．01，代表与 OVX+UP 组比较（下同）。

3 分析与讨论

3.1 IL-6和TNF-α在骨代谢中的作用及去卵巢手术对其基因表达影响

图2 TNF-α mRNA的相对表达量Fig.2 The mRNA relative expression of TNF-α

图3 TRAP mRNA的相对表达量Fig.3 The mRNA relative expression of TRAP

骨组织中的IL－6主要由成骨细胞分泌，PKG可促使OB表达IL－6。IL－6与IL－3协同支持造血干细胞及破骨细胞前体的生长；IL－6也能增强其他细胞因子或激素对破骨细胞的作用，如增强PTHrP维持体内钙平衡和调节破骨细胞骨吸收的作用。IL－1 和 TNF－α 能诱导成骨细胞产生 IL－6，IL－6 可与 PGE2协同作用通过OPG-RANKL-RANK系统来调节OC的分化。TNF-α是一种强有力的促进骨吸收的细胞因子，能诱导成骨细胞、基质细胞、T细胞、牙周韧带细胞和滑膜细胞等表达RANKL，导致OC活化。TNF-α可通过RANKL依赖途径或非RANKL依赖途径直接诱导骨髓造血干细胞向OC的分化，IL-1对其诱导的OC吸收功能有显著增强作用。TNF-α能直接刺激破骨细胞前体细胞的分化，同时刺激OB/ST产生M-CSF，促进破骨细胞的增值。另一方面，TNF-α诱导基质细胞产生M-CSF上调破骨细胞前体的RANK表达，从而通过RANKL与RANK的结合启动OC的合成。白孟海等人的研究[3]发现，对去势大鼠骨髓基质细胞进行体外培养，骨髓提取液IL-6、TNF-α含量升高，骨髓干细胞分化形成OC增加，且两者的变化趋势具有一致性。人体实验亦取得相同结果，即绝经后骨质疏松妇女血清IL-6和TNF-α水平明显高于绝经后非骨质疏松妇女，且IL-6和TNF-α水平与骨密度（BMD）呈负相关[4]。

骨是雌激素的重要靶器官之一，在成骨细胞、破骨细胞、骨细胞中均有雌激素受体（estrogen receptor，ER）存在。雌激素对骨骼的作用是通过对成骨细胞和破骨细胞的协同调节完成的。雌激素既可以作用于成骨及破骨细胞表面的受体直接影响骨形成和骨吸收，也可以通过这些细胞分泌局部调节因子或调节这些细胞对局部调节因子和全身激素的反应性来影响骨代谢。绝经后骨质疏松症的主要发病机制是机体的骨重建失衡。绝经后由于体内雌激素的迅速下降，导致机体的多种激素及细胞因子发生改变，使破骨细胞大量分化和融合，骨吸收大于骨形成，从而导致骨质疏松症。雌激素可在基因水平抑制TNF-α、IL-1、IL-6等骨吸收因子表达，增加TGFβ等成骨因子表达，进而启动破骨细胞凋亡，预防骨丢失，雌激素可以促进OPG的表达，抑制M-CSF的分泌[5]，由于M-CSF是破骨细胞增殖的重要因子，因此雌激素缺乏后的突出表现是破骨细胞的数量增多，骨吸收功能增强。

本研究的结果显示，OVX组小鼠与SHAM组小鼠相比，骨密度显著下降同时骨组织中IL-6和TNF-αmRNA的相对表达量显著升高，表明在去卵巢小鼠骨质疏松的发生过程中，骨组织中IL-6和TNF-α等细胞因子的变化起到了一定的作用。小鼠去卵巢手术后，体内雌激素水平迅速下降，致骨组织中成骨细胞、基质细胞、骨细胞及巨噬细胞等分泌的IL-6和TNF-α等细胞因子发生变化，并通过OPG-RANKL-RANK系统依赖或非依赖途径促进骨髓造血干细胞向破骨细胞的分化以及破骨细胞的增殖、分化，提高成熟OC的活性，促进骨吸收，最终导致骨密度下降，骨质疏松症的发生。

3.2 上、下坡跑台运动对去卵巢小鼠骨组织IL-6和TNF-α基因表达的影响

运动训练对于骨代谢的影响，主要是通过骨组织受到的应力、激素的分泌、以及运动造成营养吸收的改变等方面来发挥作用的，其中骨组织在运动过程中受到的应力对骨代谢的影响作用最明显[6-7]。骨组织在运动过程中受到地面的反作用力以及骨骼肌施加的各种应力，骨细胞感受到这种应力，通过机械-化学偶联将机械信号转变为化学信号来发挥作用。遍布于整个骨陷窝-骨小管网络的骨细胞是骨的初级机械感应细胞，骨细胞通过间隙连接与骨表面细胞和临近骨细胞保持联系，他们对机械刺激的反应是加快代谢、激活基因和产生生长因子和基质[8-9]。机械信号转化为化学信号是多个信号转导途径的共同结果，在骨细胞膜或细胞骨架水平被激活[10]。切应力激活G蛋白偶联的机械刺激感受器，引起胞内钙、前列腺素（Prostaglandin，PG）和一氧化氮水平的提高。一氧化氮和前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）作为中间信号，参与将机械信号转化为生化信号过程，引起机体多种激素和细胞因子发生变化，这些激素和细胞因子相互调节并构成一个复杂的网络系统，最终直接或间接地通过OPG-RANKL-RANK系统调控骨代谢[11]。Saunders等人的研究表明应力（混合应力）作用于成骨细胞后，促进OPG表达，对RANKL的表达无显著影响[12]。应力还可以调节成骨细胞分泌巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor，M-CSF），参与破骨细胞的分化与成熟[13-14]。一次性力竭运动后，血浆中骨代谢相关细胞因子水平均发生显著变化，特别是IL-6、IL-10、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）[15]。一次性大强度运动还可以提高运动员血清TGF-β的水平[16]。

在本研究中，两运动组与OVX组相比，IL-6和TNF-α mRNA的相对表达量都显著下降，这表明跑台运动对骨组织起到了较好的刺激作用，骨组织在运动过程中受到了较理想的应力，通过机械-化学偶联将机械信号转变为化学信号，使骨组织及骨髓微环境中IL-6和TNF-α等骨吸收促进因子基因表达降低，从而改善了雌激素缺乏导致的骨代谢失衡，部分阻止了骨量的下降。两运动组之间相比较，则OVX+DOWN组比OVX+UP组IL-6和TNF-α基因相对表达量显著降低，表明在改善雌激素缺乏引起的骨代谢失衡方面，下坡跑运动比上坡跑运动的效果更显著。

3.3 上、下坡跑台运动对去卵巢小鼠骨组织TRAP基因表达的影响

妇女绝经后骨质疏松症就是由于绝经后雌激素的迅速下降引起的破骨细胞大量生成及活化导致的。破骨细胞来源于骨髓造血干细胞，在某些因素的刺激下，造血干细胞可向巨噬细胞分化、融合并最终形成破骨细胞。从造血干细胞到破骨细胞的分化过程可知，造血干细胞首先分化为单核的巨噬细胞，单核的巨噬细胞在M-CSF和RANKL的的作用下，逐渐聚集、融合，并最终形成多核的破骨细胞，多核的破骨细胞在没有完全成熟的情况下，并不具有骨吸收功能，要成为成熟并具有骨吸收功能的破骨细胞，还需要经历核的极化以及特殊形态结构的出现等过程[17]。成熟的破骨细胞膜形成两种特有的结构，根据其形态学特征，分别称为绒毛缘和透亮区。绒毛缘是指高度皱褶呈指样伸向骨表面的质膜复合结构，其功能是通过释放蛋白酶原和氢离子，进而引起骨基质的吸收和降解。透亮区环形包绕绒毛缘区域，将吸收区与非吸收区分开，故也称封闭区[18]。除了形态学的标志之外，成熟的破骨细胞分泌的一些特殊的酶也可作为其标志性酶，如 TRAP 和金属蛋白酶（MMP-9）等[19]。

未成熟的破骨细胞及破骨细胞前体都不分泌TRAP，只有成熟的具有骨吸收作用的破骨细胞才会分泌TRAP，因此，通过检测TRAP的基因表达可以间接的反映各组小鼠骨组织破骨细胞生成和活化的情况。本研究的荧光定量PCR结果显示：去卵巢手术可导致破骨细胞大量分化并活化，而跑台运动可以有效抑制破骨细胞的分化和活化，且下坡跑运动优于上坡跑运动。

通过对比研究上坡跑运动与下坡跑运动对去卵巢小鼠骨组织IL-6、TNF-α和TRAP基因表达的影响，本研究发现上、下坡跑台运动对去卵巢引起的破骨细胞分化和活化有较好的预防作用，且下坡跑运动比上坡跑运动具有更好的效果。究其原因，主要是上坡跑运动和下坡跑运动在运动时对于骨的力学刺激不同。下坡跑运动每一步跑动在下落过程中所克服的垂直方向的冲量比上坡跑运动大，其骨组织所受到的地面应力也比上坡跑运动大。此数据结果与原因分析在本实验室前期已发表论文中已有阐述[20]，这里就不再详细展开。另外，此结果和本实验室前期有关纵跳运动对于骨密度的影响的研究结果相吻合[21-22]。

4 结 论

（1）跑台运动通过抑制去卵巢小鼠骨组织破骨细胞的分化和活化，从而有效预防骨质疏松症的发生，且下坡跑运动比上坡跑运动效果更明显。（2）跑台运动对去卵巢破骨细胞分化和活化的抑制作用可能与骨组织IL-6和TNF-α等细胞因子基因表达的变化有关。

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Effect of Uphill or Downhill Running on Gene Expression of IL-6，TNF-α and TRAP in Bone of Ovariectomized Mice

MA Tao，JI Liu，LI Shichang，SUN Peng
（School of PE and Health，East China Normal University，Shanghai 200241，China）

Objective：Through surgical simulation in ovariectomized mice to women with postmenopausal osteoporosis，the effect of uphill and downhill running on gene expression of IL-6，TNF-α and TRAP in ovariectomized mice was studied.Method：32 8-week-old C57 BL/6 female mice were randomly divided into 4 groups：sham operation group（SHAM），ovariectomized group（OVX），uphill running group（OVX+UP）and downhill running group（OVX+DOWN）.SHAM group mice were sham ovariectomized，and the remaining three groups of mice were ovariectomized.The rats of OVX+UP group were trained to do uphill running training which last a total of 8 weeks，the rats of OVX+DOWN group were trained to do downhill running training which last a total of 8 weeks，40 minutes each training，5 times a week.After 8 weeks，the mRNA was extracted from the right femur and the gene expressions of IL-6，TNF-α and TRAP were detected.Results：Compared with the SHAM group，the gene expression of IL-6，TNF-α and TRAP in local bone tissue of the OVX group were significantly increased.The gene expression of IL-6，TNF-α and TRAP in local bone tissue of the exercise groups were significantly decreased compared with the OVX group.OVX+DOWN group was better than OVX+UP.Conclusion：Through inhibiting osteoclast differentiation and activation in bone of ovariectomized mice，treadmill exercise can effectively prevent the occurrence of osteoporosis，and the inhibiting effect of downhill running is bigger than that of uphill running.The inhibiting effect to osteoclast differentiation and activation of treadmill exercise may be related to the changes in gene expression of IL-6，TNF-α and TRAP in bone.

treadmill exercise;ovariectomized mice;IL-6;TNF-α;TRAP

G 804.22

A

1005-0000（2011）03-0204-04

2010-12-16；

2011-04-06；录用日期：2011-04-08

教育部重点实验室开放课题基金

马 涛（1979-），男，山东菏泽人，讲师，在读博士研究生，研究方向为骨组织运动适应的生物学机制。通讯作者：季 浏（1961-），男，江苏泰兴人，教授，博士生导师。

华东师范大学体育与健康学院，上海200241。