烟台海域中度嗜盐菌分离、鉴定和系统进化研究

冯二梅，宿红艳，王磊

(鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025)

烟台海域中度嗜盐菌分离、鉴定和系统进化研究

冯二梅，宿红艳，王磊

(鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025)

为研究山东烟台海域中度嗜盐菌的分布情况及种群特征，从烟台近海盐场采集的土样和水样中利用高氏一号培养基分离得到 22 株中度嗜盐菌。通过菌落形态观察、生理生化特征分析比较，选取其中的 9 株进行 16S rDNA 序列分析和系统进化分析，结果表明这些中度嗜盐菌分别属于7 个属：芽孢杆菌属 (Bacillus)、枝芽孢杆菌属 (Virgibacillus) 、薄壁芽孢杆菌属 (Gracilibacillus)、刘氏菌属 (Liuella)、产微球茎菌属 (Microbulbifer)、拟诺卡氏菌属 (Nocardiopsis)和交替单胞菌属 (Alteromonas)，其中菌株YTM-8 、YTM-12 和YTM-13可能是潜在的新种。以上研究结果表明烟台海域中存在有较为丰富的嗜盐微生物多样性，并且潜藏着新类型的嗜盐菌资源。

烟台海域；嗜盐菌；16S rDNA；生物多样性；系统进化分析

嗜盐菌 (Halophiles) 是在海洋、盐湖、盐场以及腌制品等高盐环境中生存的微生物。特殊的生存环境使嗜盐菌具有极为特殊的生理结构和代谢机制,并且还产生了许多具有特殊功能的天然活性物质[1],对它的研究既具有理论意义,又有应用价值。近年来，嗜盐菌作为一类具有很大潜力的生物资源已被人们广泛关注。通过嗜盐菌的开发与多样性的研究，从海洋中寻找微生物新种和具有特殊功能的生理活性物质成为国内外的研究热点[2]。

根据微生物对盐浓度的反应可分为不同的种[3]，即非嗜盐菌（在含0.2 mol/L盐的培养基中生长最好)，多数普通真细菌和多数淡水微生物属于这一类群；轻度嗜盐菌（在含0.2 ～ 0.5mol/L盐的培养基中生长最好），很多海洋微生物属于这个类群；中度嗜盐菌（在含0.5 ～ 2.5 mol/L 盐的培养基中生长最好）；边缘极端嗜盐菌（在含1.5 ～ 4.0 mol/L 盐的培养基中生长最好）；极端嗜盐菌（在含2.5 ～ 5.2 mol/L盐的培养基中生长最好）和耐盐菌（能耐盐的非嗜盐菌）。其中，中度嗜盐菌（Moderately halophilic bacteria）耐盐范围宽、分布广、更易于适应高盐环境。中度嗜盐菌耐盐性很强，它们可在0.1% ～ 32.5%的NaCl浓度条件下生长[4]。目前，中度嗜盐菌的研究主要集中在生理生化特性、系统发育、嗜盐机制等方面，已有的研究结果表明中度嗜盐菌有着重要的研究价值和应用前景[5-7]。

中度嗜盐菌种类繁多，尚存在大量未分离鉴定的种质资源，限制了其研究和开发的深入。它们的分类主要依据三个方面：表型特征、化学分类数据和分子生物学数据[5]。目前我国已陆续在新疆[8]、西藏、内蒙古等地开展过对中度嗜盐菌的研究和多样性的调查。本研究从烟台近海盐场底泥中分离鉴定了一批中度嗜盐菌，并利用16S rDNA作为分子指标对这些菌株进行分子分类鉴定和系统进化分析，以期了解烟台海域中度嗜盐菌的多样性及分子系统进化情况，为进一步开发和利用打下基础。

1 材料和方法

1.1 样品的采集和菌株分离

底泥样品采集自烟台牟平东海盐场盐池，样品经梯度稀释后涂布于高氏一号培养基平板上，于28℃培养2 ～ 3周后，根据菌落大小、形态、颜色进行初步分离筛选并纯化。纯化后的菌种转接至高氏一号斜面培养基，4℃保存。

1.2 培养基

高氏一号培养基：KNO31.0 g，FeSO4⋅7H2O 0.01 g，MgSO4⋅7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，可溶性淀粉20 g，琼脂20 g，NaCl视需要添加，定容至1 000 mL。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5.0 g，NaCl视需要添加，琼脂粉15 g，定容至1 000 mL。以上不加琼脂粉为液体发酵培养基。

1.3 形态观察

菌株接种于高氏一号固体培养基上，28℃培养72 h，观察菌落大小、颜色、形态等特征。

1.4 生物学特性实验

1.4.1 耐盐度实验 供试菌株单菌落过夜震荡培养，按照1%接种量分别接种于不同NaCl浓度(1%, 3%,5%, 7%, 10%, 13%, 15%) 的LB液体培养基中，28 ℃、150 r/min震荡培养12 h，测定培养液的光密度值(OD578)。

1.4.2 温度耐受性实验 供试菌株单菌落过夜震荡培养，按照1%接种量接种于含3% NaCl的LB液体培养基中，分别置于20℃, 30℃, 37℃, 45℃, 55℃中150 r/min震荡培养12 h，测定培养液的光密度值(OD578)。1.4.3 pH值对生长影响的测定 供试菌株单菌落过夜震荡培养，按照1%接种量接种于pH值分别为4, 5,6, 7, 8, 9的含3% NaCl的LB培养液中，28℃、150 r/min震荡培养12 h，测定培养液的光密度值 (OD578)。

1.5 生理生化特性

根据相关文献[2,9]所列中度嗜盐菌生理生化指标，并参照《微生物分类学》[10]及《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)[11]和《常见细菌系统鉴定手册》[12]中有关方法进行生理生化特征的鉴定。

1.6基于16S rDNA的系统进化分析

1.6.1 基因组 DNA 的提取 采用宝生物工程(大连)有限公司的 TaKaRaMiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒提取。

1.6.2 16S rDNA基因的 PCR扩增和测序 以各菌株基因组 DNA为模板，采用正向引物：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’和反向引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’进行 PCR 扩增。PCR 反应体系 (25 µL)：10 × Buffer 2.5 µL，25 mmol/LMgCl22.0 µL，2.5 mmol/LdNTP 2.0 µL，TaqDNA 聚合酶1U，引物各2.0 µL，模板2.0 µL，双蒸水12 µL。扩增条件：94℃预变性10 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，循环35次，72℃后延伸5 min。PCR扩增产物经Elutemilk小量胶回收试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）纯化后，送上海生物工程有限公司测序。

1.6.3 系统进化树的构建和分析 根据各菌株16S rDNA的测序结果，用Blastn软件在GenBank数据库中进行相似性搜索，寻找同源序列。选取分值较高的序列采用ClustalX1.8[13]进行多序列比对 (alignment)，然后运用MEGA4.0分析软件中的邻近结合法 (Neighbor-Joining，NJ) 构建系统进化树，通过1 000次取样计算其Bootstrap值。

2 结果与分析

2.1 菌种分离结果

经分离纯化，去除重复菌株，共得到9株中度嗜盐菌，通过形态观察可初步判定其为中度嗜盐细菌和放线菌。观察结果显示YTM-8和YTM-15菌落形态特征相近，菌落白色，干燥，具有放线菌属特征，可初步判定其为同一个属。剩余菌株的形态大体相同，菌落湿润、透明，具有明显的细菌菌属特征。

2.2 表型特征

供试的9菌株的NaCl生长范围较为广泛，可在浓度为1% ～ 15%之间良好生长，最适生长NaCl浓度为3% ～ 7%，当NaCl浓度达到15%，菌株生长缓慢，只有个别的菌株生长稍好，没有发现极端嗜盐菌的存在，均为中度嗜盐菌。温度耐受性实验显示，这些中度嗜盐菌温度生长范围亦较为广泛，可在55℃的高温下较好生长，最适温度范围30 ℃ ～ 45 ℃。其pH值生长范围在4.0 ～ 10之间，最适pH为6.0 ～ 8.0不等。

依据菌落形态观察结果，YTM-8和YTM-15初步确定其属于放线菌属，因此，对其余7个供试菌株进行了23项生理指标的鉴定，其中反硝化和苯丙氨酸脱氨等反应表现为阴性；产硫化氢、V.P和精氨酸脱羧实验中只有菌株YTM-5表现阳性，其余菌株均为阴性；酪氨酸水解实验只有YTM-13为阳性；过氧化氢酶和产吲哚实验显示供试菌株均为阳性。而对YTM-8和YTM-15两个菌株只选择了14项放线菌属典型生理指标进行了鉴定(同一表中其它生理指标以0表示)，其中反硝化作用、淀粉水解、明胶水解、石蕊牛奶等反应均为阴性；吲哚实验均为阳性反应；氧化氢酶实验菌株YTM-8为阳性反应而YTM-15为阴性反应。另外，本研究分别以蔗糖、麦芽糖、核糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和甘露醇作为碳源对被测菌株进行碳源利用实验，结果表明除供试菌株YTM-6、YTW-10和YTM-13碳源利用范围较广以外，其余大部分中度嗜盐菌菌株的碳源利用范围较窄。菌株之间的生理生化特征等表型差异显著(表1)。

2.3 数据库序列比对分析结果

将测得的序列输入GenBank数据库，以Blastn程序进行相似性搜索，序列同源性比对结果见表2。

同源性小于93% ～ 95%，可以认为属于不同属，鉴定的9株菌中除了YTM-9外其余菌株均与数据库中同一属的菌株具有大于95%的同源性，由此可以确定它们的菌属：YTM-3菌株属于刘氏菌属 (Liuella)，YTM-5菌株属于芽孢杆菌属 (Bacillus)，YTM-7和YTM-12菌株属于产微球茎菌属 (Microbulbifer)，YTM-8和YTM-15菌株属于拟诺卡氏菌属 (Nocardiopsis)，YTW-10菌株属于交替单胞菌属 (Alteromonas)，YTM-13菌株属于薄壁芽孢杆菌属 (Gracilibacillus)。该鉴定结果与菌落形态观察和生理生化特征分析结果相一致。菌株YTM-9虽然也与数据库中的菌属存在较大的同源性，但是同源性最大的前5株菌中包含了3个不同的属，分别为Virgibacillus，Oceanobacillus，Bacillus，且同源性都为99%。因此其菌属的确定有赖于进一步的系统进化分析。

一般认为，16S rDNA序列同源性小于98%，可以认为属于不同的种[14,15]。除了菌株YTM-9以外的其它8个菌株中，YTM-8、YTM-12和YTM-13与数据库中的有效发表菌种之间同源性均小于98%，尤其是菌株YTM-8和YTM-12与数据库中未确定种名的菌种之间最高同源性也仅为98%和96%的相似性，它们可能是潜在的新种。YTM-15与Nocardiopsisaegyptica，Nocardiopsistangguensis同源性都是99%，也不能确定其种名，需要通过构建系统进化树确定，其它菌株与已确定种名的菌种之间同源性为99%，可以确定它们的种名。

表 1 烟台海域分离的9种中度嗜盐菌菌株生理学特性比较Tab. 1 Physiological properties test of moderately halophilic bacteria isolated from Yantai Sea area

表 2 中度嗜盐菌16S rDNA序列鉴定结果Tab. 2 16S rDNA sequences analysis result of moderately halophilic bacteria

图 1 邻接法构建的基于16S rDNA基因序列的中度嗜盐菌的系统发育树分支处的数值为bootstrap值。Fig. 1 Neighbor-Joining tree based on16S rDNA gene sequences of moderately halophilic bacteria The numbers on internal branches are bootstrap values.

2.4 系统发育分析

提取供试的9株中度嗜盐菌的基因组DNA，扩增16S rDNA片段，测定其16S rDNA序列并进行系统进化分析。依据16S rDNA序列在GenBank数据库中进行相似性搜索，选取同源性较高的相关序列构建系统发育树，经NJ法分析获得的进化树，见图1。

根据图1可以看出，9个供试菌株分别属于7个属。其中通过同源比对无法确定属名的YTM-9根据与其相近的三个菌属Virgibacillus，Oceanobacillus，Bacillus的聚类关系上看，YTM-9与Virgibacilluspicturae聚在一起，可以确定其为枝芽孢杆菌属。其它菌株的系统进化关系与同源比对结果相一致，进一步确定了它们的属名。

3 讨 论

尽管在当今“基因组学”的时代，对嗜盐菌的分离鉴定仍然是海洋微生物研究中非常重要的一项内容。如今所鉴定得到的中度嗜盐菌可能只是其冰山一角，随着分子技术水平的提高，利用分子手段去阐明中度嗜盐菌在环境中的生物多样性及明确它们的分类是今后一项长期的工作。所以，还需要更深入的积累和研究更多的中度嗜盐菌资源[16]。

为了解烟台海域中度嗜盐菌菌种资源特征，分离并获得这些嗜盐菌菌种资源，本研究通过对采集样品分离和纯化，共获得了22株嗜盐菌。选取其中9株菌株进行了个体形态观察及生理生化特性测定，通过对16S rDNA分子序列测定分析并构建了系统进化树，从而对它们进行了种属鉴定。

无论是从形态上还是从生理特性上，YTM-8菌株和 YTM-15菌株都比较接近，系统进化树也显示YTM-8和YTM-15均属于拟诺卡氏菌属 (Nocardiopsis)，但该属在进化树中分成两簇，YTM-8和YTM-15分别聚在不同的簇中。YTM-7和 YTM-12虽同属于产微球茎菌属 (Microbulbifer)，但 YTM-7与有效种Microbulbiferhalotolerans聚在一起，YTM-12则聚在另一相对独立的分支上，并形成了一个独立的亚分支，提示该菌株可能是一个潜在的新种。综合16S rDNA序列和系统进化分析，YTM-3,YTM-7和YTM-9可以初步确定种名为Liuellaqinghaiensis,Microbulbiferhalotolerans与Virgibacilluspicturae。由进化树可以看出YTM-5, YTM-8, YTW-10, YTM-13和YTM-15均与相应菌属的未定名种聚在一起，YTM-12则形成一个单独的进化支，结合数据库序列比对分析结果，菌株YTM-8, YTM-12和YTM-13与有效菌种的同源性小于98%，因此，YTM-8, YTM-12与YTM-13可能是潜在新种。

通过对烟台海域嗜盐菌鉴定和分析的初步研究充分证明了烟台海域中度嗜盐菌种群的多样性和丰富性，并可能潜藏着新类型的嗜盐菌资源。在本实验分离鉴定的7个菌属中，芽孢杆菌、交替单胞菌属、产微球茎菌和拟诺卡氏放线菌都能产生结构新颖、作用特殊的生物活性物质，具有较强的抗菌、抗病毒、抗原虫、产酶、抗肿瘤及产其它活性物质等活性，为新药的开发奠定基础[17-20]。本实验分离鉴定的中度嗜盐菌对今后进一步研究这些微生物资源具有重要意义，同时也为渤海海洋资源的深入认识和进一步开发利用提供了菌种资源。

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Isolation, identification and phylogenetic analysis of moderately halophilic bacterium isolated from Yantai Sea area

FENG Er-mei , SU Hong-yan , WANG Lei

( College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025，China )

To study the distribution and characteristics of moderately halophilic bacteria, the samples were collected from salt field near Yantai sea area in Shandong province. 22 ocean moderately halophilic bacteria strains were isolated on Gause I agar medium. Based on the morphological, physiological and biochemical analysis, the 9 strains were chosen for 16 S rDNA amplification and phylogenetic analysis. Phylogenetic analysis based on 16 S rDNA gene sequences indicated that these moderately halophilic bacteria strains belonged to 7 genera includingLiuella,Bacillus,Virgibacillus,Gracilibacillus,Microbulbifer,Nocardiopsis, andAlteromonasrespectively. The Strains of YTM-8,YTM-12 and YTM-13 may represent potential new species of their genus. The research results indicate that Yantai sea area is rich in halophilic bacterium diversity and contains new types of microorganism resources.

Yantai sea area; halophilic bacterium; 16 S rDNA; biodiversity; phylogenetic analysis

Q939

A

1001-6932(2010)01-0052-07

2009-03-12；

2009-07-03

国家自然科学基金项目( 30740017 ); 鲁东大学学科建设项目

冯二梅(1981－)，女，山东菏泽人，硕士研究生，研究方向为海洋生物技术。电子邮箱：fengermei521@163.com

宿红艳(1976－)，女，山东淄博人，副教授，博士，主要从事分子细胞生物学研究。电子邮箱：suhongyan66@126.com