自体与新鲜同种异体骨软骨移植的实验研究

应小樟 石仕元 胡德新 郑 琦 魏 威 杭州市红十字会医院骨科 杭州310003

关节软骨是一种无血管、神经和淋巴管的组织，缺乏基质干细胞，其自我修复能力极其有限。近几年国内已先后开展自体骨软骨镶嵌移植，并有良好的临床报道［1，2］。但该方法的软骨供区十分缺乏，制约了该技术的广泛应用。如何克服这种供区不足的困难，依然是关节外科医生的挑战。本实验采用含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植修复兔关节软骨缺损，并与自体骨软骨移植进行比较研究。通过大体、光镜观察及Wakitani组织学评分，探讨新鲜同种异体骨软骨移植修复关节软骨缺损的可行性，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 采用健康成年纯种新西兰大白兔16只，雌雄不限，体质量3.0～4.5 kg，由浙江中医药大学提供，饲养环境温度18～22℃。实验动物分为两组(自体软骨移植、含富集骨髓干细胞松质骨移植)，每组8只16膝。两组动物均不限制运动。手术前观察所有动物无跛行，双膝关节活动正常。

1.2 方法

1.2.1 制备软骨缺损模型 将兔用3%戊巴比妥钠，以1m l/kg体重兔耳缘静脉注射麻醉。兔双侧膝关节前内侧纵行切口，保持髌韧带完整性，将髌骨翻向外侧，显露股骨髁，在股骨髁中部髌股关节处用利刀制造相应大小的全层关节软骨缺损，深达软骨下骨质，平均深度约5.0mm。

1.2.2 自体骨软骨移植 自体移植组用特制取骨器在股骨外髁非负重区取相应大小骨软骨柱，直径约4.0mm，长度约5.0mm，分别镶嵌移植于缺损钻孔处，与所钻孔径及深度相匹配，保证牢固嵌合，并着重注意保持移植后关节面平整，无明显凹凸。缝合关节囊及滑膜，关闭切口。

1.2.3 同种异体骨软骨移植 异体移植组随机将该组动物骨软骨柱对换移植，具体手术方法同自体移植组。

1.2.4 术后处理 两组动物术后均肌注青霉素16万单位，1天1次，共用药1周，预防感染。未用免疫抑制剂，饮食条件相同。不限制运动，于术后第2周开始自由活动，于开阔环境中饲养，人为促进运动每天半小时。

1.2.5 观察方法 各组动物于术后12周处死，取股骨髁关节面骨软骨移植处为标本。①大体观察:实验动物跛行程度和恢复情况，关节活动度(固定髋关节，距膝关节远侧相等距离悬挂同等重量砝码，测量膝关节活动度)，关节内有无粘连，修复组织表面的平整光滑程度、有无凹陷，颜色、质地、移植物充填程度、与周围健康软骨组织连接情况，软骨退变情况，髌骨沟轮廓恢复情况。②组织学光镜检查:用0.1%的甲醛溶液固定缺损修复区及部分周边正常软骨，将标本以甲酸乙醇液脱钙1周，分别做苏木精—伊红染色和Masson染色切片，观察优势新生组织的性质、表面特性、与正常软骨连接等组织学特性等。组织学评分:将标本蜡块包埋、切片，行HE染色和甲苯胺蓝染色，按照Wakitani法评分标准的组织学结果评分表进行评分。

1.2.6 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件包处理，采用完全随机设计的单因素方差分析。

2 结果

2.1 活体观察 术后1周，全部动物活动减少，跋行，双膝略肿胀;1周后渐轻，稍有跋行。以后11周中采用改良的Clakeweeknesser检查标准(固定髓关节，距膝关节远侧相等距离悬挂同等重量砝码，测量膝关节活动度)测量动物关节伸屈活动范围，可见术后12周，自体骨软骨移植组膝关节活动度均优于同种异体移植骨软骨组(P＜0.01)，见表1。

2.2 标本大体观察 ①自体骨软骨移植组:关节腔无粘连，无积液，关节液淡黄色，关节内无退变增生。关节面颜色呈乳白色，和周围软骨面无明显差异，表面光滑平整，与周围正常软骨融合良好。②异体骨软骨移植组:关节囊有少许挛缩，质硬，关节内纤维束带与关节表面充填组织有少许粘连，移植骨软骨柱与受区融合，界限模糊。移植的软骨面萎缩变薄，少数有软骨面破损，关节面不平，色灰暗，标本软骨面整个被包裹在纤维组织与炎性组织中，股骨的髌骨关节沟轮廓不清，退变增生严重。

表1 两组膝关节伸屈活动范围比较±s)度

表1 两组膝关节伸屈活动范围比较±s)度

组 别 n/只 术后4周 术后8周 术后12周8 45.15±2.15 57.51±3.92 68.35±3.75异体骨软骨移植组 8 44.76±2.48 48.21±2.51 52.97±3.53 P自体骨软骨移植组＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 组织学光镜观察 ①自体移植组:骨组织与受区骨性愈合，关节软骨的厚度与受区正常软骨基本一致，软骨为透明软骨特性，透明软骨细胞排列规律，可见软骨陷窝，潮线清楚，表面平整无退变。②同种异体骨软骨移植组:移植物软骨下板层、骨髓松质骨与宿主基本连接愈合，但松质骨小梁周围尚未完全骨化。新生的关节软骨细胞幼稚占多数。交界处淋巴细胞、浆细胞和多核白细胞浸润减少。无移植的其他缺损区无软骨形成。

2.4 组织学评分 按照Wakitani法评分标准的组织学结果评分表进行评分，设5项观察指标:细胞形态学、基质染色(异染性)、表面规则性、软骨厚度、与周围软骨整合度。其中，细胞形态学评分为:透明软骨0、透明软骨为主1、纤维软骨为主2、少量软骨3、无软骨4;基质染色(异染性)评分为:正常0，轻度减少1，明显减少2，无异染性颜色3;表面规则性评分为:光滑0，中等1，不规则2，极度不规则3;软骨厚度评分为:＞2/3为0，1/3～2/3为1，＜1/3为2;周围软骨整合度评分为:边缘完全整合为0，一侧边缘整合为1，未整合为2。

术后12周，按照Wakitani法评分标准自体骨软骨移植较新鲜异体骨软骨移植在细胞形态、基质染色、表面平整、软骨厚度、周围接合及总分方面，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

3 讨论

关节软骨损伤后自身修复能力十分有限，较大面积的缺损无法自行修复。临床上应用的方法主要有:①微骨折技术:通过穿透软骨下骨板，使包含骨髓多能间充质干细胞的血凝块聚集在软骨缺损区的表面，形成含有Ⅱ型胶原的纤维软骨覆盖缺损区。该技术操作简单易行、成本低下，常被用作首选的治疗方案。综合各方面的文献资料［3～5］，该方法适用于软骨缺损面积小于1cm2的患者。②骨软骨的嵌镶移植术:自体骨软骨移植的方法是通过关节边缘非负重区作为供区，选择软骨厚度适宜的部位，获取一定数量、大小及长度的骨软骨柱作为移植物，待处理好受区后予以植入，不需固定。该方法完好地保持了关节软骨和骨床的紧密连接，具有取材方便，植入稳定，愈合成活率高及关节软骨修复能力强等优点，而且可以在关节镜下完成手术。近几年在国内已先后开展该手术，临床报道效果良好。而同种异体骨软骨嵌镶移植的效果却报道不一，未在临床上开展。

表2 两组移植面组织学评分比较(±s)

表2 两组移植面组织学评分比较(±s)

只 细胞形态 基质染色 表面平整 软骨厚度 周围接合 总分自体骨软骨移植组 16 0.13±0.34 0.38±0.50 0.25±0.45 0.25±0.45 0组 别 n/.38±0.50 1.38±1.71异体骨软骨移植组 16 2.88±0.62 2.13±0.34 2.25±0.45 1.88±0.34 1.88±0.34 11.00±4.04 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

目前的实验研究主要集中在两个方面:①组织移植:主要有自体或异体的骨软骨、软骨、骨膜等。②细胞移植:主要有自体或异体富集骨髓干细胞松质骨的脑胎软骨细胞、软骨膜细胞、骨髓干细胞、转基因细胞及与载体一起在体外培养构建的工程软骨等。

组织工程化关节软骨的研究近几年不断增加，研究主要集中在软骨组织工程载体、种子细胞和生物调控因子等方面。载体材料包括天然和人工合成可降解的复合物。天然材料主要有胶原、明胶、纤维蛋白和藻酸盐等，存在的问题主要是力学性能差，极易为活性酶降解，吸收过快。人工合成高分子聚合物具有良好的生物相容性，常用的有聚酸乳、聚羟基乙酸及其共聚物。种子细胞目前常用的有软骨细胞、骨髓基质干细胞(BMSCs)和胚胎干细胞(ESs)。生物调控因子繁多，其中以骨形态发生蛋白(BMP)的研究最多，现在采用基因重组技术已成功分离和克隆出近40种BMP，在体外诱导软骨表型分化方面发挥了显著的作用。国内学者以藻酸盐、聚乳酸、骨基质明胶为载体，采用骨髓间充质干细胞或软骨细胞修复兔软骨损伤方面已取得一定的成果［6～8］。总体分析，该类方法操作复杂，用于临床尚早。

本实验探讨同种异体骨软骨用于修复负重区软骨缺损的可行性。通过采用多种观察指标比较了自体和同种异体骨软骨移植两种方法修复关节软骨缺损的效果。实验结果显示，新鲜无处理的同种异体骨软骨镶嵌移植修复关节软骨缺损不行，其排斥反应及吸收破坏严重，疗效不确切，不建议使用。

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