原子力显微镜的原理及其在生命科学中的应用

李艳青 智丽丽

(1,2.昌吉学院物理系 新疆 昌吉 831100)

原子力显微镜的原理及其在生命科学中的应用

李艳青1智丽丽2

(1,2.昌吉学院物理系 新疆 昌吉 831100)

本文简述了原子力显微镜的工作原理及其工作模式,并且阐述了每种工作模式的优缺点,着重介绍了原子力显微镜在生命科学中所发挥的重要作用,并指出了原子力显微镜在研究生物样品过程中所存在的问题,以及原子力显微镜在生命科学中的发展前景。

原子力显微镜;工作模式;应用

1 引言

光学显微镜的出现使人们能够观察到用肉眼看不到的物质细节,如生物细胞,因此它已经成为生命科学研究必不可少的重要工具。但是普通的光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制,不可能分辨比λ/2(λ为光波波长)更小的物体,其分辨率的极限只能达到 4×10-7m,最大放大倍数只有 2000。随后发明的电子显微镜虽然具有非常高的分辨率,但它难以精确地揭示物质的表面微观结构,其复杂的制样要求限制了其在活性生物分子等方面的研究应用。到了二十世纪八十年代,Binning和 Rohrer[1]发明了扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,ST M),随后,在扫描隧道显微镜的基础上又发展起来了其他各种新型扫描探针型表面分析仪器 (SPM),原子力显微镜就是其中的一种。扫描探针显微镜(SPM)集光电子技术、激光技术、计算机高速采集和控制,以及高分辨率图形处理于一体,利用探针与样品之间的电、光、磁力、热等物理关系,获得样品表面和内部信息。

1986年诞生了原子力显微镜 (atomic force microscope,AFM)[2],这种高分辨率的扫描探针显微镜能够应用到包括绝缘体在内的各种样品研究中。

2 原子力显微镜的工作原理及工作模式

2.1 原子力显微镜的工作原理

原子力显微镜(AFM)是Binnig等人在 ST M的基础上发展起来的扫描探针显微镜,它利用原子之间的范德华力来呈现样品的表面特性,可获取纳米级分辨率的活生物体等表面结构信息。

AFM有一个对力非常敏感的微悬臂,其尖端有一个微小的探针,当针尖与样品表面接触的时候,针尖与样品表面上的原子之间存在一个非常微弱的相互作用力使微悬臂弯曲,该形变信号转变为光电信号并进行放大,就可以得到原子之间相互作用力的信号。AF M通过测量探针针尖与样品表面原子间力的大小来描绘样品的表面形貌,它不受样品是否具有导电性的限制,可以对导体、半导体和绝缘体进行测量,因此AFM的出现补偿了 ST M不能观测绝缘体的缺陷,为生命科学领域的发展做出了很大贡献。图1为AFM工作原理及仪器结构示意图。

2.2 原子力显微镜的工作模式

根据原子间作用力(引力或斥力)的不同,AFM成像分为接触模式(Contact mode AFM,C-AFM)、非接触模式 (Non-Contact mode AFM,NC-AFM)和轻敲模式 (Inter mittent-contact(tapping mode) AFM,T M-AFM)三种工作模式,如图 2。

接触模式中,针尖和样品表面之间的距离仅有几个埃,针尖与样品之间的作用力在范德华力的排斥区域。非接触模式中,针尖与样品表面之间的距离是 50-100埃,针尖与样品之间的作用力在范德华力的吸引区域。当针尖与样品之间的作用力在范德华力的吸引和排斥区域之间的时候,此工作模式被称为轻敲模式,针尖与样品表面之间的距离大约是 10-50埃。图 3为原子间的 Lennard-Jones曲线,在图中可以看出有三个区域:(l)接触区域,代表的是AF M接触模式;(2)非接触区域,代表AFM非接触模式;(3)在接触区和非接触区两者之间区域,代表 T M-AFM模式。

图 3 原子间力一距离曲线

接触模式下,针尖前端的单个原子与样品表面的单个原子之间存在排斥力,敏感的微悬臂因为排斥力发生弯曲。利用这一现象可以测量出原子间接近时的相互排斥力,一般可以测得两个原子之间的力为 10-8N左右。接触的情况下由于摩擦力的存在可以引起悬臂的偏转,不同的摩擦力使悬臂的偏转不同,运用该特点可以来检测针尖与样品表面之间摩擦力的大小,一般可以测得摩擦力的大小 10-11N左右。此模式下,针尖与样品的距离比较近,成像的分辨率高。但是,当扫描软样品时,针尖和样品表面强的排斥力会造成样品原子位置的改变,引起软样品的损伤;同时,软样品的原子容易粘附在探针针尖上,污染针尖不利于成像,所以,接触模式一般不适合扫描软样品,例如:生物大分子、低弹性模量以及容易移动和变形的样品。

非接触模式下针尖与样品表面距离较远,相互作用力较弱,有利于研究软生物样品。但是,该模式下针尖与样品之间的距离较远,分辨率相比接触模式和轻敲模式将降低,而且成像很不稳定,操作相对困难,在生物研究中很少使用。

处在两者之间的被称为轻敲模式(Tapping mode AFM,T M-AFM)。轻敲模式类似于非接触模式,但是,轻敲模式下微悬臂的共振频率的振幅比较大,一般在 20nm左右,AFM的针尖在振荡的时候与样品的表面只是轻轻接触,因此被称作轻敲模式。由于轻敲模式能够避免针尖粘附到样品上,以及在扫描过程中对样品几乎没有损坏,所以轻敲模式可以对液体中活性生物样品进行现场检测、对溶液反应进行现场跟踪等。

3 原子力显微镜在生命科学中的应用

原子力显微镜(AF M)不仅仅能对单个分子进行观测,而且还能对单个分子进行自由操纵[3]。到目前为止AFM的研究已从原子、小分子、有机分子、高分子直至生物分子,涉及到生物技术、微探测及纳米技术、微电子技术、实际生产等方面,其在物理、化学、医学、材料学以及微电子学等方面都有广泛的应用前景,特别是在生物大分子的观察与操纵方面已经取得了很大进展。

原子力显微镜已经在生命科学领域得到了广泛的应用[4]。自从 Lindsay等人首次用 AFM获得DNA分子的图像以来,AFM已经成为研究DNA分子的重要工具。Hans ma等人首次在丙醇中得到了质粒DNA可重复的AFM图像,他们通过AFM切割遗传物质脱氧核糖核酸分子的指定位置,这是人们第一次利用AFM对生物分子进行的可控制性的纳米操纵[5]。vesenka等人[6]在大气的环境下获得了脱氧核糖核酸的重复性的AF M图像。最近几年以来,通过改善AFM样品制备方法,改进探针针尖的分子修饰,更重要的通过 T M-AFM成像,一些科研工作者获得超分辨的DNA以及DNA的复合物的图像[7]。目前,原子力显微镜还不能解决DNA分子的核苷酸序列,但是,通过原子力显微镜已经研究出了高级DNA与蛋白质的复合物,并且可以研究单个DNA分子的长度、宽度和高度。Martin等人[8]用AF M实时观察到了环状和棒状DNA聚合体的自组装、DNA聚合体的运动和结构的变化过程。

首先用原子力显微镜研究的蛋白质是 halobacterium halobim的紫膜上的视紫红蛋白[9]。对于一些游离蛋白质,科学家们也在这方面获得了很大的成功,例如:胶原蛋白、免疫蛋白、肌动蛋白、蛋白聚合酶和巨球蛋白等等[10]。由于AFM能在液体和近生理条件下获得高分辨的形貌图,因此,在蛋白质成像方面得到了广泛的应用,主要有:研究蛋白分子形状的改变,观察蛋白质的微观内部构造,探索蛋白质的动力学过程,实时观测蛋白质的自组装过程,进行原子力显微镜的单分子操纵、检测蛋白质的表面特性等[11-13]。

原子力显微镜在多糖方面的研究起步比较晚,多糖都具有很大的分子量,支链较多,在溶解方面比较困难,均一性较差,因此,形貌图的效果比较差,分辨率低。但是,最近原子力显微镜在多糖方面的研究取得了很大进展[14]。马秀俐等人[15]利用原子力显微镜观测到西洋参多糖的分子链为多股形状并且紧密并行螺旋排列,每股螺旋直径约为 200-250nm左右。Round等人[16]利用原子力显微镜研究了果胶多糖的支链结构和相互交织的网状结构,支链的存在直接影响果胶多糖的粘度性质,即便在很低的浓度下,仍然可以看到单个聚集体的存在。李艳青等人[17]利用原子力显微镜研究了多糖黄原胶分子,观测出该糖微观结构随温度和退火时间有着规律性的变化,为生物体组织再造提供了一个有效的途径。

以上实验均通过AFM得到高分辨率的形貌图像,由于原子力显微镜可在液态环境中工作,所以AFM可对活细胞进行观测其动态生化反应,分辨率横向高达 10-10×10-11m,这些图像利用电子显微镜是不易观察到的。

4 原子力显微镜研究生物样品时存在的问题

原子力显微镜虽能够观测到单个原子,但这是受一定的条件制约的,在观测生物大分子时,远远达不到这样的分辨率,主要原因在于进行原子力显微镜扫描时一般采用轻敲模式,该模式下几乎无法得到原子量级的图像,如果利用接触模式,对生物样品会存在损害。另一方面,针尖的曲率半径是影响原子力显微镜分辨率的一个重要因素,经过几十年的发展,新型碳纳米管针尖可以大大改善针尖曲率半径对分辨率的影响。因此碳纳米管针尖是AFM探针的未来发展的一个重要方向。

通常情况下原子力显微镜的扫描速度比较低,需要几分钟的时间才能得到一个高分辨率的图像。然而,对于很多的化学反应都是在很短的时间内完成的,因此,原子力显微镜不能实时观测化学反应的变化,有待科学界进一步探究。

5 结论与展望

AFM在不同的工作模式,不同的环境下可以得到生物的表面形貌,表面特性以及动力学过程等信息,它已经成为研究生命科学领域中不可缺少的有力工具,随着研究的深入,必将促进生物科学进入新的发展时代。

近年来,随着科学技术的不断改进和发展,许多新的 AFM工作模式 (如磁场操作模式 MACAFM)[18]不断涌现,使得AFM所得图像更接近于真实图像,而且,对样品破坏程度大大降低。另一方面,AFM与其他技术联用(如电子显微镜),将会进一步提高对生命科学的研究能力,AFM的功能以及应用范围也将不断的扩大和深入,必将推动科学的巨大进步。

[1]G.Binnig,H.Rohrer,C.Gerber,E.Weibel.Appl.Phys.Lett.,1982,40:178.

[2]G.Binning,C.F.Quate,C.Gerber,Phys.Rev.Lett.,1986,56:930.

[3]H.G.Hansma et al.,Science,1992,256:1180.

[4]G.U.Lee,L.A.Chrisey.,Science,1994,266:771.

[5]H.G.Hansma,J.Vesenka,C.Siegerist.et al,Science,1992,256:1180.

[6]J.Vesenka,M.Guthold,C.L.Tang.et al,Ultramicroscopy,1992,42-44:1243.

[7]Han W,Lindsay S M,Dlakic M,Harrington R E.nature,1997,386:563.

[8]A.L.Martin,M.C.Davies,B.J.Raekstraw.et al,.FEBS Letters,2000,480:106

[9]Butt H J,Downing K H,Hans ma P K.Biophysical J,1990,58:1473.

[10]Arakawa H,Umemura K,Ikai A.Nature,1992,358:171.

[11]G.M.Hand,D.J.Muller,B.Nieho1Son.et al,J.Mol.Biol,2001,315:587.

[12]M.KamermanS,I.Fahrenfort,K.SchultZ.et al,Science,2001,292:1178.

[13]J. I.Kourie,H.B.Wood.Prog,Biophys.Mol.Biol,2000,73:91.

[14]Kirby A R,Gunning A P.Morris V J.biopolymers.1996,38:355.

[15]马秀俐,白玉白,刘忠英等.西洋参多糖(PPQ-d)的原子力显微镜观察[J].吉林大学自然科学学报,2000,(1): 105.

[16]Round A N,Rigby N M.et al,Carbohydrate Research.2001,331:337.

[17]Yanqing Li. et al,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 2009,74:136.

[18]Ge G,Han D,Lin D.et a1,Ultramicroscopy,2007,107:299.

O561.1;TG115.21+5.7

A

1671-6469(2010)03-0112-05

2010-05-17

昌吉学院院级课题(2010SSQD021和 2010SSQD020)

李艳青 (1982-),男,河南省项城市人,昌吉学院物理系,助教,研究方向:原子力显微镜对生物大分子的研究。

(责任编辑:代琴)