好氧反硝化芽孢杆菌筛选及其反硝化特性

安 健,宋增福,杨先乐,黄志华,张小能

上海海洋大学水产与生命学院,国家水生动物病原库,上海 201306

好氧反硝化芽孢杆菌筛选及其反硝化特性

安 健,宋增福,杨先乐＊,黄志华,张小能

上海海洋大学水产与生命学院,国家水生动物病原库,上海 201306

从对虾养殖池塘中筛选出多株具有好氧反硝化性能的芽孢杆菌,其中芽孢杆菌 YX-6能够在 14 h内将ρ(亚硝酸盐氮)由 10 mg/L降至 0;ρ(DO)为 5.2～5.8 mg/L时,该菌对亚硝酸盐氮的去除率接近 100%.试验选取具有降氮功能的芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究了芽孢杆菌 YX-6在不同 pH,温度,ρ(亚硝酸盐氮)和盐度时的好氧反硝化性能.结果表明,芽孢杆菌 YX-6的好氧反硝化性能显著高于阳性对照菌 (P＜0.05).通过对芽孢杆菌 YX-6的形态学观察、生理生化及 16S rDNA分子鉴定,初步鉴定其为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans).

好氧反硝化;芽孢杆菌;亚硝酸盐

自 20世纪 80年代 ROBERTSON等[1]首次分离出好氧反硝化细菌〔Thiosphaera pantotropha,现更名为脱氮副球菌 (Paracoccus denitrificans)〕以来,好氧反硝化细菌的分离及其反硝化性能的研究与应用得到了迅速发展,目前已发现多个属的细菌具有好氧反硝化功能,如 Microvirgula aerodenitrificans[2-5],副球菌属 (Paracoccus sp.)[6],假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[7-10]和产碱杆菌属 (Alcaligenes sp.)[11-12]等.好氧反硝化细菌最重要的特点是能够在有氧环境中发挥反硝化作用,将 NO-或NO-还原为N2[1].好氧反硝化细菌的发现与研究,拓宽了人们对微生物反硝化现象的认识,为有氧条件下氮素的去除开辟了新的途径.

水产养殖中,过量的亚硝酸盐氮对水生动物具有相当的毒害作用,并有可能进一步诱发细菌病、病毒病等病害,给水产养殖业造成巨大的经济损失.每年类似的报道屡见不鲜,在夏季高温季节,这种情况更为突出[13-14].因此,养殖水体亚硝酸盐氮的有效去除是水产业亟待解决的问题之一.

在目前高密度集约化养殖模式下,氧气的充足供给是保证健康水产养殖的必要条件;而传统反硝化细菌多为厌氧菌,有氧条件下其对亚硝酸盐氮的降解性能必定受到一定的抑制,这毫无疑问地将造成现有生产模式与传统降解亚硝酸盐氮方法之间的矛盾,好氧反硝化细菌恰恰为解决该矛盾提供了思路和出路.

芽孢杆菌作为益生功能菌已得到广泛应用,目前虽有一些关于芽孢杆菌降解亚硝酸盐氮作用的报道[15-16],但大都停留在试验研究阶段;同时,由于养殖水体环境的复杂多变与菌种降氮稳定性不足等因素的影响,即使有所应用,效果也并不理想.因此,笔者从生产实际出发,筛选能适应复杂养殖水体环境、降解亚硝酸盐氮性能稳定的优质芽孢杆菌,进而有效地解决养殖水体有氧条件下亚硝酸盐氮的积累问题,以期为水产动物的健康养殖提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

试验所用样品采集于高密度对虾养殖池水与池塘底泥.

1.1.2 对照菌种

阳性对照菌选用有降氮功能的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BYK00318-01-01和蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus)BYK00045-01-01(由国家水生动物病原库提供).

1.1.3 培养基

LB液体培养基：蛋白胨 10 g/L,牛肉膏 5 g/L,NaCl 5 g/L,pH 7.0.

LB固体培养基：在 LB液体培养基中添加琼脂15～20 g/L.

LB高盐培养基：在 LB液体培养基中将 NaCl的量增至 30 g/L.

BTB培养基[17]：天冬酰胺酸 1 g/L,KNO31 g/L,KH2PO41 g/L,FeCl2·6H2O 0.05 g/L,CaCl2·2H2O 0.2 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,BTB 1 g/L,琼脂 20 g/L,pH 7.0～7.2.

反硝化培养基 (测定性能)：琥珀酸钠 4.72 g/L,NaNO20.05 g/L,KH2PO41.5 g/L,Na2HPO40.42 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,pH 7.2.

所有培养基经 0.11 MPa,121℃,灭菌 20 min.

1.2 方法

1.2.1 好氧反硝化芽孢杆菌的筛选

1.2.1.1 耐盐芽孢杆菌的筛选

将采集的水样与泥样先在 LB液体培养基(NaCl 5 g/L)中培养 18～24 h后,于 75～80℃水浴锅中处理 10～15 min,再将培养物在 LB高盐培养基 (NaCl 30 g/L)固体平板中进行稀释涂布,选取生长良好的单个、不规则、表面粗糙的菌落反复划线分离进行纯培养.

1.2.1.2 好氧反硝化芽孢杆菌的初筛及复筛

将筛选出的耐盐芽孢杆菌稀释涂布在 BTB显色平板上,30℃下培养 1～2 d,挑选出能够使 BTB平板变成蓝色的菌种为目的初筛菌.将初筛菌种活化后按 1%(体积比)的量接入 100 mL反硝化培养基中,30℃,200 r/min下摇瓶培养 24 h,测定溶液中的ρ(亚硝酸盐氮),选择亚硝酸盐氮去除量较多的菌株为复筛菌.

1.2.2 好氧条件下芽孢杆菌的反硝化性能

1.2.2.1 细菌生长与好氧反硝化性能的测定

试验菌株经纯培养 18 h后按 1%(体积比)的添加量接种到 200 mL的反硝化培养基中,30℃,200 r/min下摇床振荡培养,每隔 2 h取样 1次,每次取样 10 mL,先测定细菌光密度 A600,然后经8 000 r/min离心,取上清液测定培养液中的ρ(亚硝酸盐氮).

1.2.2.2 溶解氧与菌体反硝化性能的测定

试验菌株经纯培养 18 h后,按 1%(体积比)的添加量接种到 100 mL反硝化培养基中,通过摇床控制转速分别为 0,100,150,200,250和 300 r/min,培养 24 h后测定培养液中的ρ(亚硝酸盐氮)和ρ(DO).

1.2.2.3 不同 pH下细菌对亚硝酸盐氮的降解

试验菌株经纯培养 18 h后按 1%(体积比)的添加量接种到 pH分别为 3,5,7,9和 11的 100 mL反硝化培养基中,30℃,200 r/min下摇床振荡培养24 h后,测定ρ(亚硝酸盐氮);同时,以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究试验菌株在不同 pH下的反硝化性能.

1.2.2.4 不同温度下细菌对亚硝酸盐氮的降解

试验菌株经纯培养 18 h后按 1%(体积比)的添加量接种到 100 mL反硝化培养基中,分别在 10,15,20,25,30,35和 40℃下经 200 r/min摇床振荡培养 24 h后,测定ρ(亚硝酸盐氮);同时,以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究试验菌株在不同温度条件下的反硝化性能.

1.2.2.5 不同ρ(亚硝酸盐氮)对细菌好氧反硝化性能的影响

试验菌株经纯培养 18 h后,按 1%(体积比)的添加量分别接种到初始ρ(亚硝酸盐氮)为 20,40,60,80和 100 mg/L的 100 mL亚硝酸盐氮反硝化培养基中,30℃,200 r/min下摇床振荡培养 24 h后,测定ρ(亚硝酸盐氮);同时,以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究试验菌株在不同ρ(亚硝酸盐氮)下的反硝化性能.

1.2.2.6 不同盐度下细菌对亚硝酸盐氮的降解

配制盐度分别为 5,10,15,20,25和 30的人工海水并添加反硝化培养基,将纯培养 18 h后的菌株按 1%(体积比)的添加量分别接种到 100 mL反硝化培养基中,30℃,200 r/min下摇床振荡培养 24 h后,测定ρ(亚硝酸盐氮);同时,以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究试验菌株在不同盐度下的反硝化性能.

1.2.3 分析方法

ρ(亚硝酸盐氮)的测定采用 N-1-萘 -乙二胺比色法[18];A600的测定采用紫外分光光度法;ρ(DO)的测定采用碘量法 (GB7489—87).

1.2.4 试验结果的统计分析

试验结果用平均值 ±标准方差 (n=3)表示,运用 SPSS.11.0软件,经 One-Way ANOVA分析,采用Duncan’s多重检验分析试验结果平均值的差异显著性,设差异水平α=0.05(P＜0.05为差异显著).

2 结果与分析

2.1 好氧反硝化芽孢杆菌筛选

对采集水样与泥样进行菌种分离,初步筛选出18株细菌,通过形态及染色观察后发现这 18株细菌均为革兰氏阳性菌,产芽孢.将这些细菌通过BTB培养基初筛,从中筛选出 8株能够使 BTB平板变色的细菌,对这 8株细菌的好氧反硝化性能进行比较研究,最终筛选出一株能够高效降解亚硝酸盐氮的菌株,该菌对亚硝酸盐氮的去除率可达 100%,经生理生化及 16S rDNA分子鉴定,该菌与凝结芽孢杆菌的亲缘关系最近,同源性达 98%,初步鉴定其为凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans)(数据另有文章报道),试验中以芽孢杆菌 YX-6命名.

2.2 好氧条件下芽孢杆菌的反硝化性能

2.2.1 细菌生长与好氧反硝化性能的测定

如图 1所示,随着细菌的生长,4 h后芽孢杆菌YX-6得以迅速增殖,该阶段为细菌的对数生长期;同时,芽孢杆菌 YX-6能够在 14 h内将初始量为 10 mg/L的亚硝酸盐氮降解为 0,去除率达 100%.2.2.2 ρ(DO)对细菌反硝化性能的影响

图 1 芽孢杆菌YX-6生长与亚硝酸盐氮的降解曲线Fig.1 Dynamicsof Bacillus YX-6 growth and degradation curvesof nitrite nitrogen

如图 2所示,随着摇床转速的增大,反硝化培养基中的ρ(DO)不断增高.芽孢杆菌 YX-6对亚硝酸盐氮的去除率也随着ρ(DO)的增高而增大,但当ρ(DO)超过 5.8 mg/L时,该菌对亚硝酸盐氮的去除率逐渐降低.

图 2 ρ(DO)对芽孢杆菌 YX-6降解亚硝酸盐氮的影响Fig.2 Effectsof DO mass concentration on the nitrite nitrogen degradation of Bacillus YX-6

2.2.3 pH对细菌降解亚硝酸盐氮的影响

如图 3所示,3种菌的反硝化活性均能在 pH为7时达到最大,而芽孢杆菌 YX-6能够在 pH为 5～9的范围内对亚硝酸盐氮的去除率保持近 100%.pH为 3时,芽孢杆菌 YX-6对亚硝酸盐氮的去除率可达 80%,pH为 11时其仍具有一定的反硝化活性;而 2株阳性对照菌在 pH为 3和 9～11的范围内的反硝化活性则相对较低.

2.2.4 温度对细菌降解亚硝酸盐氮的影响

如图 4所示,随着温度的升高,3株菌的反硝化活性不断增加,当温度为 30℃时,3株菌的反硝化活性均达到最大,对亚硝酸盐氮的去除率接近100%.随着温度的继续升高,3株菌的去除率有明显下降的趋势,相比 2株阳性对照菌,芽孢杆菌YX-6能够在 25～40℃的范围内始终保持较高的反硝化活性,在 40℃的高温下其对亚硝酸盐氮的去除率仍可达 90%以上.

图 3 p H对细菌降解亚硝酸盐氮的影响Fig.3 Effectsof pH on the nitrite nitrogen degradation of strains

图 4 温度对细菌降解亚硝酸盐氮的影响Fig.4 Effectsof temperature on the nitrite nitrogen degradation of strains

2.2.5 ρ(亚硝酸盐氮)对细菌反硝化性能的影响

如图 5所示,当ρ(亚硝酸盐氮)为 20 mg/L时,芽孢杆菌 YX-6和枯草芽孢杆菌均可保持较高的反硝化活性,其对亚硝酸盐氮的去除率接近 100%.随着初始ρ(亚硝酸盐氮)的增高,3株菌的反硝化性能逐渐降低.当ρ(亚硝酸盐氮)为 100 mg/L时,芽孢杆菌 YX-6对亚硝酸盐氮仍有近 20%的去除率.

图 5 ρ(亚硝酸盐氮)对细菌反硝化性能的影响Fig.5 Effectsof nitritemass concentration on the nitrite nitrogen degradation of strains

2.2.6 盐度对细菌降解亚硝酸盐氮的影响

如图 6所示,当盐度为 5～15时,3株菌始终保持较高的反硝化活性,随着盐度继续增高,3株菌对亚硝酸盐氮的去除率逐渐降低,其中芽孢杆菌YX-6和蜡样芽孢杆菌的去除率相对较高.在盐度为 30的高盐度水环境中,蜡样芽孢杆菌对亚硝酸盐氮的去除率几乎为 0,而芽孢杆菌 YX-6仍有近30%的去除率.

图 6 盐度对细菌降解亚硝酸盐氮的影响Fig.6 Effectsof salinity on the nitrite nitrogen degradation of strains

3 讨论

好氧反硝化细菌在自然界中广泛存在,现已有多种分离方法能够有效地筛选出好氧反硝化细菌[19-20].目前已分离出较多种类的好氧反硝化细菌,但多数菌种为阴性菌[1-12],带有潜在的致病性;同时,部分菌种对水体中溶解氧的耐受性较差,反硝化效率偏低[21-23].因而,当前所分离出的菌种不适合高密度水产养殖的亚硝酸盐的降解应用,筛选适合水产养殖应用的好氧反硝化细菌优良菌种及其快速筛选方法的研究已显得尤为必要.笔者在该试验条件下,通过对好氧反硝化芽孢杆菌的筛选,先分离出有一定耐盐特性的益生芽孢杆菌,再对具有好氧反硝化性能的芽孢杆菌进行初筛及复筛,最终筛选出一株高性能的好氧反硝化芽孢杆菌 YX-6,该菌能够在 14 h内将 10 mg/L的亚硝酸盐氮降解为 0,去除率达 100%.

ρ(DO)对细菌的反硝化性能至关重要.PATUREAU等[2,24]认为,反硝化还原酶系和有氧呼吸系统同时存在于好氧反硝化细菌中,缺少 NO->x或O2都会降低细菌的生长率和反硝化效率.HUANG等[25]研究指出,溶解氧是细菌进行好氧反硝化的关键因素,当ρ(DO)为 2～6 mg/L时,最适于细菌生长及反硝化性能的发挥.该研究表明,随着ρ(DO)的增加,芽孢杆菌 YX-6的反硝化性能不断提高,在ρ(DO)为 5.2～5.8 mg/L时该菌的反硝化活性最高,其对亚硝酸盐氮的去除率接近 100%,可见该菌的反硝化活性与ρ(DO)密切相关;但当ρ(DO)超过 5.8 mg/L时,该菌对亚硝酸盐氮的去除率明显下降.这与于爱茸等[16]的研究结果相左,同时也很难用阈值理论来解释,可见不同菌种的好氧反硝化机制存在较大差异,需作进一步研究.

研究表明,反硝化作用主要发生在细菌的对数生长期,该阶段随着菌体的快速增殖,水体中硝态氮、亚硝态氮的量迅速下降[26],这与马放等[27]的研究结果相符.pH对细菌反硝化作用的发挥有较大影响,pH过高或过低均会抑制反硝化还原酶的活性.GUPTA等[28-29]的研究表明,细菌反硝化还原酶的最适 pH是中性或微碱性,当环境 pH偏离该最适范围时,细菌的反硝化活性会相应降低.该研究发现,芽孢杆菌 YX-6对环境 pH的变化显示出了较强的适应能力,其能够在 pH为 3～11的范围内保持较高的反硝化活性;在 pH为 5～9的范围内,该菌对亚硝酸盐氮的去除率保持接近 100%,显著高于阳性对照菌.这远比文献[16,30]中报道的好氧反硝化细菌 pH适应范围要广,可能是由于该菌株的反硝化还原酶对 pH耐受性较强等原因所致.

温度是影响反硝化还原酶活性的一个重要因素,反硝化作用最适温度范围为 25～35℃,温度过高或过低,均会抑制反硝化还原酶的活性[31].该研究表明,芽孢杆菌 YX-6的反硝化最适温度也在该温度范围内.在 25～40℃范围内芽孢杆菌 YX-6对亚硝酸盐氮的去除率可达 90%以上,而阳性对照菌在 40℃高温下的反硝化活性几乎丧失.这可能与芽孢杆菌 YX-6的反硝化还原酶耐热机能有关,需进一步对其反硝化还原酶基因的耐热特性进行研究.由此表明,芽孢杆菌 YX-6的反硝化还原酶热稳定性更好,更适合用于高水温环境的降氮应用.

养殖水体亚硝酸盐的过度积累,不仅会对水生动物产生毒害作用,而且一定浓度的亚硝酸盐还会抑制菌体的反硝化活性,而有关亚硝酸盐对细菌反硝化活性影响的研究鲜见报道.该研究表明,芽孢杆菌 YX-6在高浓度的亚硝酸盐环境下仍可保持较高的去除率,其对亚硝酸盐毒性的耐受性显著强于阳性对照菌,当ρ(亚硝酸盐氮)超过 20 mg/L时会对菌体反硝化还原酶活性产生抑制作用,可见 20 mg/L的ρ(亚硝酸盐氮)是抑制细菌反硝化活性的一个临界值.这与于爱茸等[16]的研究结果相近,可见亚硝酸盐对菌体反硝化还原酶的基因表达具有一定的影响.

自然界嗜盐细菌主要包括古细菌中的Haloarcula,Halobacterium,Haloferax及细菌中的Halomonas和 Bacillus等属的某些种[32].YOSH IE等[33]研究指出,盐度对菌体反硝化还原酶活性有一定的抑制作用.有关芽孢杆菌反硝化活性与盐度的相关研究国内鲜见报道.该研究表明,在盐度为 0～30的范围内,芽孢杆菌 YX-6对亚硝酸盐氮均可保持较高的去除率;盐度为 30时,其对亚硝酸盐氮仍然可保持近 30%的去除率.这可能与芽孢杆菌的耐盐机制及菌种的分离环境有关,该特性使得芽孢杆菌 YX-6在海水养殖降氮及淡水养殖降氮等方面的应用存有较大优势.

目前有关芽孢杆菌属的菌种,如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniform),均有文献报道[15,34]其具有好氧反硝化性能.该研究筛选出的芽孢杆菌 YX-6经生理生化及 16S rDNA测序分析,初步鉴定其为凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans).笔者对凝结芽孢杆菌的好氧反硝化性能及其与养殖水体环境因子的相互影响作了较为充分的研究,但有关该菌的好氧反硝化特性及反应机制仍需作进一步研究.

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Screening of Aerobic Denitrifying Bacillus and Study on Denitrification Characteristics

AN Jian,SONG Zeng-fu,YANGXian-le,HUANG Zhi-hua,ZHANGXiao-neng
State Collection Center of Aquatic Pathogen,College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai
201306,China

Many Bacillus strains with aerobic denitrification character were isolated from the water and sediment of shrimp culture ponds.Among them,the Bacillus YX-6 could degrade nitrite nitrogen from 10 mg/L to zero in 14 h,aswell as app roximately 100%of nitrite nitrogen removal rate at a DO mass concentration of 5.2-5.8 mg/L.Furthermore,in comparison with the denitrifying Bacillus selected as the positive control,the denitrification characteristics of Bacillus YX-6 were tested under different pH,temperature,nitrite concentration and salinity.The results showed that the aerobic denitrification characteristics of Bacillus YX-6 were significantly higher than those of thepositive control(P＜0.05).According tomorphological observation,physiological and biochemical properties,and 16S rDNA molecular identification,the Bacillus YX-6 was identified p rimarily as Bacillus coagulans.

aerobic denitrification;Bacillus;nitrite

X17

A

1001-6929(2010)01-0100-06

2009-06-08

2009-08-20

国家公益性行业科研专项 (nyhyzx07-042);现代农业产业技术体系建设专项资金项目(nycyts-49-17)

安健 (1983 -),男,内 蒙 古 呼 和 浩 特 人,anjian520@sohu.com.

＊责任作者,杨先乐 (1948-),男,湖南桃源人,教授,博导,主要从事水产动物免疫、鱼类药理学与渔药的检测与监控、水产动物疾病控制的理论与技术研究,xlyang@shou.edu.cn

(责任编辑：潘凤云)