水产品中碱性嫩黄O残留量的液相色谱-串联质谱测定

张海琪,梁丽军,2,何中央,施礼科

(1.浙江省水产质量检测中心,浙江杭州 310012;2.浙江工业大学化学工程与材料学院,浙江杭州 310032)

水产品中碱性嫩黄O残留量的液相色谱-串联质谱测定

张海琪1,梁丽军1,2,何中央1,施礼科1

(1.浙江省水产质量检测中心,浙江杭州 310012;2.浙江工业大学化学工程与材料学院,浙江杭州 310032)

建立了水产品中碱性嫩黄O工业染料残留的高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定方法。样品经甲醇超声提取、旋转蒸发浓缩、过滤后,在正离子电喷雾离子源(ESI+),多反应监测(MRM)模式下进行测定。方法线性范围为2.5～100μg·L-1,在添加水平为5.0～20.0μg·kg-1时的平均回收率为78.9%～92.1%,相对标准偏差小于11%,定量限为0.5μg·kg-1。

高效液相色谱-串联质谱;碱性嫩黄O;碱性染料;水产品

碱性嫩黄O(Auramine O)别名盐基淡黄O、盐基槐黄、碱性荧光黄GR,是一种芳香胺类碱性工业染料,其结构示于图1,主要用于棉织品、人造丝、纸张、皮革、油漆等染色[1]。碱性类工业染料比食用色素更易在食品中染色,且不易褪色、价格低廉,因此常被一些不法水产商用来对鱼、虾等进行染色。

对水产品进行染色来增加产品的色相,以次充鲜[2-4]。有资料表明:碱性嫩黄O对皮肤黏膜有轻度刺激,可引起结膜炎、皮炎和上呼吸道刺激症状,人接触或者吸入都会引起中毒[5],且很难自然降解,体内残留物具有毒性、致癌性、致突变[6],给消费者的健康带来了严重危害。因此,不允许在食品中使用,且未曾在《食品添加剂食用卫生标准》(GB 2760—2007)中列出[7]。

目前,有关食品中碱性染料检测方面的研究报道有:水产品中孔雀石绿、结晶紫及其它们的代谢物检测[8-10],豆制品中碱性嫩黄O、碱性橙的检测[5,11-12]。而关于水产品中碱性嫩黄O的检测未见报道。本工作对样品前处理方法、液相色谱条件、质谱条件进行系统优化,拟建立水产品中碱性嫩黄O残留分析的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法。

图1 碱性嫩黄O的结构式Fig.1 The structure of Auramine O

1 实验部分

1.1 主要仪器

Agilent 1100 HPLC仪(美国Agilent公司产品)-API3000三重四极杆质谱(美国ABI公司产品),配有自动进样器、电喷雾离子源;高速冷冻离心机;L G 10-2.4A型高速台式离心机;WH-866型涡旋混合仪;KQ-800DB型可控温超声波仪;Milli-Q纯水器;R2OS增强型旋转蒸发仪;微型高速万能试样粉碎机。

1.2 主要材料与试剂

碱性嫩黄O(CAS No.2465-27-2,C.I.41000):购自Sigma-Aldrich公司;甲醇、甲酸(色谱纯),无水乙醇(分析纯):购自Merck公司;实验用水为Milli-Q超纯水。样品为均质后的中华鳖,黄鱼,蟹类水产品。

1.3 标准溶液

精密称取10 mg碱性嫩黄O标准品,置于100 mL棕色瓶中,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,配成浓度为100 mg·L-1标准品储备液,置于-4℃冰箱中保存。取2.5 mL标准品储备液,用无水乙醇定容至100 mL,配成浓度为2.5 mg·L-1标准品工作液,冷藏保存。

1.4 样品前处理

取5.00 g(精确到0.05 g)已均质的样品于50 mL聚丙烯离心管中,加入10 mL甲醇,超声提取15 min,8 000 r·min-1离心10 min,重复提取2次,合并提取液,于45℃水浴中旋转蒸发至近干。用70%甲醇水溶液溶解残渣并定容至10 mL。取适量的定容液,10 000 r·min-1离心10 min,上清液过0.22μm滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件 Waters Atlantis C18色谱柱(2.1 mm×150 mm×5μm);柱温30℃;进样量10μL;流速200μL·min-1;流动相:乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B);梯度洗脱:0 min A 10%(φ),1 min A 10%(φ),2 min A 100%(φ),9 min A 100%(φ),9.1 min A 10%(φ),15 min A 10%(φ)。

1.5.2 质谱条件 电喷雾正离子(ESI+)电离模式,多反应监测(MRM)方式,单位分辨率,电喷雾电压5 000 V,辅助气流速7 L·min-1,离子源温度500℃,聚焦电压200 V,入口电压5 V,出口电压22 V,雾化气7.58×104Pa,气帘气6.21×104Pa,碰撞气4.83×104Pa。监测离子对,去簇电压(DP),碰撞气能量(CE)列于表1。

表1 碱性嫩黄O优化后的MRM参数Table1 Optimized multiple reaction monitoring parameters for Auramine O

2 结果与讨论

2.1 质谱定量定性

根据碱性嫩黄O分子结构的特征,实验选用电喷雾正离子(ESI+)电离模式以流动注射泵连续进样对标准液进行Q1全扫描,找出准确的[M+H]+m/z268.3峰为碰撞诱导解离的母离子,继续对其子离子进行Q3全扫描,找出2～3个信号较强的碎片离子,示于图2。再以母离子与子离子组成监测离子对,以多反应监测模式对待测物进行定性和定量检测,同时优化去簇电压、聚焦电压、碰撞能量等质谱条件。其中CE对离子对的丰度影响最大,示于图3。接着用FIA方式优化雾化气,气帘气,碰撞气,电喷雾电压等参数(优化后的质谱条件如1.5.2)。

从离子扫描图可以得出,碱性嫩黄O的主要碎片离子为m/z252.2、147.1、122.3、107.4,选择m/z252.2、147.1、107.4作为碱性嫩黄O的特征碎片离子。为了满足欧盟2002/65/EC指令规定,对于禁用药物的质谱确证方法需要4个IPs,选择m/z268.3/147.1为定量离子对,m/z268.3/147.1和m/z268.3/252.2为定性离子对进行定量定性分析。裂解途径推断如下:碱性嫩黄O的氯化物m/z303.8脱氯断裂后得到分子离子m/z268.3,分子离子m/z268.3脱去芳香胺上的甲基得到m/z252.2[M+-HCH3],分子离子m/z268.3脱去其中1个苯胺得到m/z147.1[M+-C6H5NC2H6],m/z14711进一步脱去酰胺得到m/z122.3[M+-C6H4NC2H6-CN]),m/z122.3继续脱掉1个甲基得到m/z107.4,示于图2。

图2 碱性嫩黄O离子扫描图和解离图Fig.2 Product ion scans spectra and proposed fragmentation scheme of Auramine O

图3 不同碰撞能量对离子对丰强度的影响Fig.3 The effects of collision energy on the intensity of product

2.2 色谱条件优化

选择流动相时,比较了乙腈和含不同体积分数(0%～0.3%)甲酸的水溶液,发现当甲酸含量为0.1%时,各待测物的响应值相对较高,在很大程度上增加了目标物的分子离子化程度和检测灵敏度,所以最终选用乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相,并采取梯度洗脱程序。加标样品和标准品的MRM色谱图示于图4,从图4可见,优化后的色谱条件可以将4种目标物和基质干扰很好的分开,获得各组分的良好分离。

2.3 线性范围和检出限

取适量体积的标准品工作液,用空白样品提取液配制成浓度为2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg·L-1的系列标准工作液,以峰面积y对待测物的质量浓度x(μg·L-1)作标准曲线方程,得方程为y=519x+249,相关系数r=0.999 7。实验表明,碱性嫩黄O在2.5～100 μg·L-1浓度范围内,质谱均有良好的线性响应。以10倍信噪比计算方法的定量限(LOQ)为0.5μg·kg-1。

2.4 基质效应、回收率与精密度实验

为了考察基质离子抑制对定量结果的影响,在5.0、10.0和20.0μg·kg-1的添加水平下,采用空白样品提取液加标和标准溶液进行比较,结果发现,空白样品提取液加标回收率低于35%,标准溶液回收率可达90%以上,离子化效率为40%～75%,可见存在着基质减弱效应,严重影响实验回收率。因为没有找到碱性嫩黄O与之相匹配的内标物,所以采取外标法进行,在实验中考虑扣除基质干扰,从而提高定量的准确性。

图4 多反应监测模式下碱性嫩黄O的MRM色谱图a.空白样品;b.空白加标样;c.标准溶液Fig.4 Chromatograms of Auramine O by MRM mode

对中华鳖、黄鱼、蟹3种不同基质的水产品进行5.0、10.0、20.0μg·kg-1三个水平的添加回收实验,结果列于表2。实验表明,在添加浓度为5.0～20.0 g·kg-1范围内,平均回收率在78.9%～92.1%之间,RSD在4.2%～10.8%之间。

表2 水产品中加标回收率试验结果(n=4)Table2 Results of spiked recovery experiments(n=4)

2.5 方法应用

应用上述LC-MS/MS法分别对中华鳖,黄鱼,蟹类等水产品进行检测。结果表明,该方法具有快速简单、检出限低、实用性强、抗干扰能力强等特点,能够对痕量样品进行很好的定性定量认证,满足动物源性食品中碱性工业染料残留检测的要求,可为水产食品安全监督检测提供有力的技术依据。

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Determination of Auramine O in Fishery Products by High-Performance Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Hai-qi1,LIANG Li-jun1,2,HE Zhong-yang1,SHI Li-ke1
(1.Zhejiang Fishery Quality Testing Center,Hangzhou310012,China;2.College of Chemical Engineering and Materials Science,Zhejiang University ofTechnology,Hangzhou310032,China)

Auramine O in fishery products was determined by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectromety.Sample was ultrasonically extracted from homogenized samples with methanol,then concentrated and purified.Analytes were finally determined by electrospray ionization(ESI)in positive mode using multiple reactions monitoring(MRM).The method was validated,and good results were obtained with respect to spiked recovery.The linear range is from 2.5 to 100μg·L-1.The average recoveries are between 78.9%and 92.1%in the spiked range of 5.0—20.0μg·kg-1,its relative standard deviation is lower than 11%.The limit quantification(LOQ)is 0.5μg·kg-1.

high-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry;Auramine O;basic dye;fishery products

O 657.63

A

1004-2997(2010)01-0048-05

2009-04-01;

2009-12-03

浙江省重大农业科技攻关项目(No.2007C02002-2)资助

张海琪(1977～),男(汉族),浙江温岭人,高级工程师,从事水产种质与质量安全研究。E-mail:zmk407@126.com