检测痕量Hg2+的DNA电化学生物传感器

戈 芳 曹瑞国 朱 斌 李经建,* 徐东升,*

(1北京大学化学与分子工程学院,分子动态与稳态结构国家重点实验室,北京分子科学国家实验室,北京 100871; 2三明学院化学与生物工程系,福建三明 365004)

检测痕量Hg2+的DNA电化学生物传感器

戈 芳1,2曹瑞国1朱 斌1李经建1,*徐东升1,*

(1北京大学化学与分子工程学院,分子动态与稳态结构国家重点实验室,北京分子科学国家实验室,北京 100871;2三明学院化学与生物工程系,福建三明 365004)

通过自组装方法将修饰有二茂铁基团的富T序列DNA分子(DNA-Fc)固定在金电极表面,得到了一种基于DNA修饰电极的电化学汞离子(Hg2+)传感器.当溶液中有Hg2+存在时,Hg2+可与修饰电极上DNA的T碱基发生较强的特异结合,形成T-Hg2+-T发卡结构,使DNA分子构象发生改变,其末端具有电化学活性的二茂铁基团远离电极表面,电化学响应随之发生变化.示差脉冲伏安法(DPV)结果显示:DNA末端二茂铁基团的还原峰在0.26 V(vs饱和甘汞电极(SCE))附近,峰电流随溶液中Hg2+浓度的增加而降低;Hg2+浓度范围在0.1 nmol·L-1-1 μmol·L-1时,电流相对变化率与Hg2+浓度的对数呈现良好的线性关系.该修饰电极对Hg2+的检测限为0.1 nmol·L-1,可作为痕量Hg2+检测的电化学生物传感器.干扰实验也表明,该传感器对Hg2+具有良好的特异性与灵敏度.

生物传感器;Hg2+;DNA; 构象变化; 示差脉冲伏安法; 电化学阻抗谱

近年来,许多无指示剂的传感器引起了大家的广泛关注和研究兴趣[1-2],DNA电化学生物传感器便是其中的一种.这类传感器通过键合在DNA分子上电活性基团的电化学响应变化,对目标物可实现快速灵敏的检测.已有报道的DNA电化学生物传感器在疾病诊断、基因测序、食品安全、环境检测、法医鉴定和无机离子检测等领域[3-6],均具有良好的灵敏度和选择性.

由于生产技术的发展以及城市人口的迅速增长,环境污染逐渐演化成为一个重大的社会问题,特别是环境中的重金属污染,对人类健康构成了很大的威胁.更为严重的是,一些重金属及其化合物不能被微生物所降解,易于在活体中富集,不仅对环境中的生物造成毒害,还间接危害到人类的健康.汞是对人类健康和环境最具危害性的剧毒元素之一,人体中汞的安全浓度是0.1 μg·mL-1,当其浓度达到0.5-1.0 μg·mL-1时人体就会出现明显的中毒症状,从而引发一系列神经、精神等方面的疾病.美国环境保护局(EPA)确定的饮用水标准中汞的浓度上限为10 nmol·L-1[7].因此,建立一种能准确快速测定痕量汞的方法具有重要的意义.

目前,测定痕量汞的方法主要有等离子体电感耦合质谱法(ICP-MS)[8-9]、阳极溶出伏安法[10-13]、荧光探针法[14-17]等.这些方法或者需要昂贵的仪器,较长的分析周期,或者需要复杂的样品预处理步骤.和传统的检测方法相比,基于电极表面分子构象变化的电化学生物传感器具有简单、灵敏、快速、廉价等诸多优点,新型电化学生物传感器的研究也日益受到重视.本文利用自组装方法构建了检测Hg2+的DNA电化学生物传感器,通过电极表面DNA分子和Hg2+作用造成的构象变化,检测溶液中的Hg2+浓度.首先,在金电极表面组装修饰有二茂铁基团的富T序列DNA探针,汞与探针分子的T碱基可形成THg2+-T发卡结构[18-19],从而使 DNA构象发生改变,通过DNA末端二茂铁基团氧化还原电流的变化,实现了对痕量Hg2+的快速检测.

1 实验部分

1.1 试 剂

DNA序列:5′-S-S-TTCTTTCTTTCCCCCCTTG TTTGTT-NH2-3′(购自上海生工生物工程技术服务有限公司);二茂铁甲酸(购自苏州永拓医药科研有限公司,经重结晶纯化);三羟甲基氨基甲烷(Tris,纯度≥99.9%,购自北京欣经科生物技术有限公司);1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳化二亚胺(EDC,纯度≥98.5%,购自Alfa Aesar公司);N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,纯度≥99.9%,购自Alfa Aesar公司);三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP,纯度≥99%,购自Sigma公司);亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6,纯度≥98.5%,购自Alfa Aesar公司);铁氰化钾(K3Fe(CN)6,纯度≥99.0%,购自Alfa Aesar公司).其他试剂均为国产分析纯.实验用水均为Milli-Q超纯水系统制备(购自Millipore公司,美国).

1.2 仪 器

二茂铁修饰DNA探针(DNA-Fc)的纯化采用NAP-5分离柱(illustraTM NAP-5 Columns,购自GE Healthcare).电化学实验采用三电极系统:工作电极为金电极(购自天津艾达科技发展有限公司,直径3.0 mm),对电极为铂片电极,参比电极为饱和甘汞电极(SCE).示差脉冲伏安法(DPV)和电化学交流阻抗谱(EIS)测定在CHI 650A型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)及Potentiostat/Galvanostat Model 283和频率响应仪FRD100(EG&G,Princeton Applied Research,USA)上进行.

1.3 实验方法

1.3.1 二茂铁修饰DNA探针(DNA-Fc)的合成与纯化

二茂铁修饰的DNA探针按文献方法[20-21]合成并纯化:

合成:用20 mmol·L-1磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(PBS,pH=5.4)配制1 mmol·L-1二茂铁甲酸溶液,取500 μL二茂铁甲酸溶液,加入50 μL 100 mmol·L-1EDC(二者的摩尔比为1∶10)和125 μL 100 mmol·L-1NHS,反应15 min.再取250 μL反应产物与250 μL DNA(5′-S-S-TTCTTTCTTTCCCCC CTTGTTTGTT-NH2-3′,100 μmol·L-1)反应2 h.

纯化:先以20 mL 10 mmol·L-1PBS缓冲溶液(含1 mol·L-1NaCl)平衡NAP-5柱,加入386 μL合成DNA样品,然后加入114 μL PBS缓冲溶液.之后再加入1 mL PBS缓冲溶液洗脱,接取流出产物.得到的探针DNA分子置于-20℃的冰箱中保存.

1.3.2 电极预处理

将金电极用Pirahna洗液(98%H2SO4与30% H2O2的体积比7∶3)浸泡30 min,再依次使用1.0、0.3和0.05 μm Al2O3粉末打磨,并用无水乙醇和超纯水超声清洗各5 min,使金电极表面成光滑镜面.再将电极置于稀硫酸溶液中进行电化学处理,至金电极达到稳定的伏安图[22].电极表面用高纯N2吹干.

1.3.3 探针DNA在金电极表面的自组装固定

取二茂铁修饰的探针DNA溶液(约50μmol·L-1) 10μL,加入10μL三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP,10 mmol·L-1),反应60 min,将双硫键切断.再加入480 μL PBS缓冲溶液(100 mmol·L-1),其中含有1.5 mol· L-1NaCl,0.1 mmol·L-1Mg2+,pH=7.4,将探针DNA浓度稀释至1 μmol·L-1.取50 μL探针DNA溶液滴加到金电极表面,于4℃冰箱中自组装16 h.依次用含有1 mol·L-1NaCl的PBS缓冲溶液(10 mmol·L-1, pH=7.4)和超纯水淋洗电极表面以除去未组装的DNA,得到自组装DNA修饰电极.将电极浸入PBS缓冲溶液(100 mmol·L-1,含1 mol·L-1NaCl)中于4℃保存24 h,将其活化.

1.3.4 电化学检测

示差脉冲伏安法(DPV)实验条件:缓冲溶液为10 mmol·L-1PBS(pH=7.4),支持电解质为1 mol·L-1NaCl,扫描电位为0-0.5 V(vs SCE),阶跃电位为25 mV,扫描速率为10 mV·s-1.交流阻抗法:频率范围从0.1 Hz到100 kHz,电解质溶液为2 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-,支持电解质为0.1 mol·L-1KCl.

2 结果与讨论

2.1 DNA修饰电极的电化学表征

电化学阻抗谱是检测生物分子修饰电极界面结构的有力工具[23-26].我们以[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-为探针,考察DNA生物传感器在不同制备阶段中界面阻抗的性质.图1为二茂铁DNA组装前后金电极的电化学阻抗图.用Randles和Ershler等效电路对阻抗谱进行拟合(图1右上角),所得参数列于表1.其中Rs为电解质溶液电阻,Cdl为界面区间电荷产生的双电层电容,ZW(Warburg阻抗)为电极反应受扩散步骤控制时的电解阻抗,Rct为界面发生氧化还原反应的电荷转移电阻.从表中数据可见,金电极表面修饰前后的Rs基本一致,不受电极表面重构的影响.Rct的大小反映了电极反应的难易程度,是电极/电解质界面电子转移动力学的特征参数.DNA组装到金电极表面,其磷酸骨架上的负电荷阻碍了[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-负离子在电极表面的电子转移,使得Rct从6.402×102Ω增大到2.014×104Ω,相差近两个数量级,证实二茂铁修饰的DNA探针已被固定到电极表面.

图1 金电极修饰DNA探针前(a)后(b)的电化学阻抗谱图Fig.1 Nyquist plot of gold electrode before(a)and after(b)modification with DNA-FcInset is the modified Randle′s equivalent circuit of Nyquist plot. electrolyte solution:2 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-+0.1 mol·L-1 KCl;Rs:electrolyte resistance,Cdl:double-layer capacitance, ZW:Warburg resistance,Rct:charge-transfer resistance

2.2 DNA修饰电极对汞的示差脉冲伏安(DPV)电流响应

图2为自组装电极与Hg2+作用后示差脉冲伏安法(DPV)测定其还原电流的变化.作用前DNA末端二茂铁基团的 DPV还原电流为 2.5 μA;与 100 nmol·L-1Hg2+作用后,电流减小为1.75 μA,但峰电位(0.26 V)基本保持不变.

将DNA修饰电极浸入不同浓度的Hg2+溶液中,检测修饰电极的DPV电流变化,如图3所示.Hg2+在0.1 nmol·L-1-1 μmol·L-1浓度范围内都有电化学信号的改变,还原峰值电流随Hg2+浓度的增加相应地减小,而峰电位基本保持在0.26 V.以峰电流的相对变化率(i0-i)/i0(i0为无Hg2+时的峰电流,i为浸入Hg2+溶液后的峰电流)对Hg2+浓度的对数作图,如图4所示,(i0-i)/i0与lgcHg2+在该浓度范围内呈良好的线性关系,线性系数R为0.97318,线性方程为i= 0.0783lgcHg2++0.5327.该修饰电极对Hg2+的检测限为0.1 nmol·L-1.

表1 金电极的等效电路中各元件的拟合参数Table 1 Equivalent circuit parameters for gold electrode

图2 DNA探针修饰电极浸入100 nmol·L-1Hg2+溶液中10 min前(a)后(b)的示差脉冲伏安图Fig.2 Differentialpulsevoltammetry(DPV)responses of DNA-Fc modified electrode before(a)and after(b) being immersed in 100 nmol·L-1Hg2+for 10 min

2.3 干扰离子的检测

为了测试该DNA生物传感器对Hg2+的特异性,将DNA修饰的金电极分别浸在CaCl2、PbCl2、Mn(CH3COO)2、CuCl2、Al2(SO4)3、CrCl3、Zn(NO3)2、CdCl2等浓度为1 μmol·L-1的不同溶液中进行DPV检测,结果如图5所示.由图可见,各种金属离子(包括Pb2+、Mn2+、Ca2+、Al3+、Cr3+、Zn2+和Cd2+,Cu2+除外)的峰电流变化远远小于Hg2+,说明DNA修饰电极上的T碱基与Hg2+的结合有很好的特异性,其它金属离子对Hg2+的检测没有干扰,因此该传感器对Hg2+具有很好的选择性.检测结果中Cu2+的峰电流异常增大,可能是因为Cu2+与DNA有复杂的结合作用,使得DNA在电极表面上构象发生变化,这和文献报道的结果[2]一致.

图3 DNA探针修饰电极检测不同Hg2+浓度的DPV图Fig.3 DPV responses of DNA modified electrode immersed in different concentrations of Hg2+cHg2+/(nmol·L-1):(a)0,(b)0.1,(c)1,(d)10,(e)50,(f)100,(g)500,(h)1000

图4 峰电流相对变化率((i0-i)/i0)与Hg2+浓度(0.1 nmol·L-1-1 μmol·L-1)对数(lgcHg2+)的关系Fig.4 Plot of relationship between peak current change ratio((i0-i)/i0)and logarithm value of Hg2+ concentration from 0.1 nmol·L-1to 1 μmol·L-1

2.4 DNA电化学生物传感器的机理探讨

针对DNA在金电极表面的自组装结构有很多研究报道[27-28],一般采用的是小分子和DNA混合组装的方法,来消除DNA和金电极基底之间的非特异性相互作用.在没有小分子自组装层的情况下,单链DNA结构柔韧易弯曲,暴露在外面的碱基很容易吸附在金电极的表面,其构象倾向于平躺在电极表面上.此时DNA末端的电化学活性基团更易接近电极表面,从而发生电子转移,表现出较强的电化学响应.当DNA发生杂交后,原本暴露在单链外侧的碱基通过互补配对转移到分子内部,使其与金电极之间的非特异性相互作用减弱,末端电化学活性基团远离电极表面,表现出明显的响应电流变化.图 6给出了传感器工作原理示意图,当将自组装电极浸入目标Hg2+中,DNA中的T碱基与Hg2+结合,形成了T-Hg2+-T发卡结构,单链DNA刚性增强,导致链端二茂铁基团远离电极表面,电子传递受到抑制, DPV峰电流也相应地减小.

图5 DNA修饰电极浸在1 μmol·L-1的不同溶液中DPV峰电流相对变化率(i0-i)/i0Fig.5 DPV peak current change ratio(i0-i)/i0of DNA modified electrode immersed in different solutions with concentration of 1 μmol·L-1

图6 DNA电化学生物传感器检测Hg2+的原理示意图Fig.6 Schematic illustration of DNA electrochemical biosensor for Hg2+detection S denotessulfhedrylattheterminalofDNA.

3 结 论

制备了末端带电化学活性基团二茂铁的巯基DNA探针,通过巯基与金的强键合作用,将其固定在金电极表面,得到单链DNA修饰电极.用电化学阻抗法对修饰电极进行了表征;利用DPV方法对目标Hg2+进行检测.在不加其它指示剂条件下,该电极在相当宽的Hg2+浓度范围内均有电化学响应,并且峰电流的相对变化率与Hg2+浓度对数在0.1 nmol· L-1-1 μmol·L-1范围内呈现良好的线性关系,检测限低达0.1 nmol·L-1,可作为痕量Hg2+检测的DNA电化学生物传感器.在干扰离子存在下该传感器对Hg2+有特定的选择性,能对水样中痕量Hg2+进行快速检测.本方法简便、快速,在环境保护方面具有潜在的应用价值.

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April 6,2010;Revised:May 27,2010;Published on Web:June 4,2010.

DNA Electrochemical Biosensor for Trace Hg2+Detection

GE Fang1,2CAO Rui-Guo1ZHU Bin1LI Jing-Jian1,*XU Dong-Sheng1,*
(1Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,State Key Laboratory for Structural Chemistry of Unstable and Stable Species, College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University,Beijing 100871,P.R.China;2Department of Chemical and Biological Engineering,College of Sanming,Sanming 365004,Fujian Province,P.R.China)

In this paper we demonstrated a novel type of electrochemical Hg2+biosensor based on a DNA-modified electrode.Ferrocenyl-modified T-rich DNA(DNA-Fc)molecules were synthesized for use as electrochemical probes. We then fixed these DNA-Fc probes onto a gold electrode surface by self-assembly.In the presence of Hg2+,the single strand DNA on the electrode surface turned to a thymine-Hg2+-thymine(T-Hg2+-T)hairpin structure.The ferrocenyl groups were kept away from the surface of the electrode,and this could be measured sensitively by differential pulse voltammetry(DPV).The results show a reduction peak of ferrocene at 0.26 V(vs saturated calomel electrode(SCE))and the peak current of DPV decreased with increasing the concentration of Hg2+.The rate of current change is linear with regards to lgcHg2+over a concentration range from 0.1 nmol·L-1to 1 μmol·L-1and with a detection limit of 0.1 nmol·L-1. A test for interference metal ions showed that this electrochemical biosensor based on a DNA modified electrode is highly sensitive and selective,and it can be widely used for trace Hg2+detection.

Biosensor;Hg2+;DNA;Conformational change;Differential pulse voltammetry; Electrochemical impedance spectroscopy

O646

*Corresponding authors.Email:lijj@pku.edu.cn,dsxu@pku.edu.cn;Tel:+86-10-62755948,+86-10-62760360.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20573008,50821061),National Key Basic Research Special Foundation of China(2006CB806102),and National Key Basic Research Program of China(973)(2007CB936201).

国家自然科学基金(20573008,50821061),国家重点基础研究项目特别基金(2006CB806102)及国家重点基础研究发展计划项目(973) (2007CB936201)资助项目