SHP2抑制剂NSC-87877对炎性疼痛的抑制作用及其机制

杨鸿斌，杨 娴，曹 静，李 帅，刘燕妮，索占伟，郑城容，崔鸿斌，郭 忠，胡晓东

(1.兰州大学药学院分子药理研究所，兰州 730000;2.兰州大学第二医院急救中心，兰州 730030;3.西北民族大学医学院，兰州 730030)

外周组织损伤引起的炎性病理性疼痛是常见病、多发病，目前临床上常用的镇痛药物对此类疼痛的疗效较差或无效。近年来的研究认为［1］:脊髓背角NMDA型谷氨酸受体在病理性疼痛的形成中发挥至关重要的作用。NMDA受体是由2个NR1亚基和2个NR2A亚基(简称NR2AR)或2个NR2B亚基(简称NR2BR)组成的异构型受体。深入探讨参与慢性疼痛的NMDA受体亚型，发现特异性阻断NR2BR，对炎性疼痛能够产生强大的抑制作用［1］，提示NR2BR的功能异常亢进，可能是导致病理性疼痛的关键因素。

我们的前期研究显示［2］:伴随着炎性疼痛的形成，脊髓突触NR2BR的表达水平会明显升高，这可能是诱发NR2BR功能亢进的重要途径。值得注意的是:NR2BR的突触表达，受到一系列蛋白酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶的调节［3，4］。干预这些酪氨酸激酶/磷酸酶的作用、以降低NR2BR的突触表达，可能具有潜在的镇痛价值。

SHP2(src homology-2 domain-containing phosphatase 2)是一种重要的蛋白酪氨酸磷酸酶［5-7］，广泛参与细胞凋亡、白血病等生理、病理过程。本研究首次探讨了SHP2在脊髓背角的分布，并深入研究了SHP2抑制剂NSC-87877［8］对炎性疼痛的影响及其与调节NR2B突触表达的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 8-Hydroxy-7-［(6-sulfo-2-naphthyl)azo］-5-quinolinesulfonic acid disodium salt(NSC-87877;Tocric Bioscience;USA);完全佛氏佐剂(Sigma);抗NR2B、NR2A的特异性抗体(Millipore Corporation，Temecula，CA，USA);抗 SHP2 抗体(武汉博士德);辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Baltimore，PA，USA);ECL 发光试剂盒(江苏碧云天)。

1.2 方法

1.2.1 疼痛模型制备 昆明种小鼠(♂，18～22 g)，由兰州大学实验动物中心提供。左后足底皮下注射20 μl CFA;对照组注射等容量生理盐水。

1.2.2 行为学测试 在模型制备前、后，通过Up-Down法［2］测定 Von Frey纤维诱发的缩足阈值(PWT)。

1.2.3 鞘内给药 为减少损伤，我们没有采用鞘内置管的方法［9］，而是将一根 25 μl微量注射器，于L5-L6椎骨间隙直接经皮穿刺，以进针产生空洞感、或动物轻微甩尾作为针尖进入蛛网膜下腔的标志［10］，缓慢推注药物 5 μl;对照组给予等容量生理盐水。

1.2.4 亚细胞结构的分离 动物用苯巴比妥钠(30 mg·kg-1，ip)麻醉，锥形板切开术，分离 L4-L5节段脊髓背角，在RIPA细胞裂解缓冲液中匀浆［2］，用于总蛋白的测定。上述组织匀浆，通过梯度离心，提取富含突触后致密质(PSD)的亚细胞结构［2］，方法为:匀浆液(homogenates;H)1 000×g离心10 min，收集上清液(S1)，弃去沉淀(P1);S1继续10 000×g离心15 min，收集富含突触小体(crude synaptosomal fractions)的沉淀P2，弃去上清(S2);P2在含有0.5%Triton X-100的细胞裂解缓冲液中孵育15 min，32 000×g离心20 min，最后弃去上清(S3)，收集富含PSD的亚细胞结构P3。以上所有操作均在4℃进行。

1.2.5 免疫印迹 50 μg蛋白上样;8%SDSPAGE电泳分离蛋白、并印迹于PVDF膜;5%脱脂牛奶封闭1 h，用相应蛋白的特异性抗体4℃孵育过夜;洗涤;HRP标记二抗室温孵育1 h;ECL发光试剂盒显像;利用Image J软件进行图像统计分析。

2 结果

2.1 SHP2在脊髓背角中的分布 免疫印迹实验显示:SHP2存在于脊髓背角(Fig 1A);而且在突触小体(P2)、突触后致密质(P3)等亚细胞结构中都能够检测到SHP2(Fig 1A)，提示SHP2可能参与脊髓痛觉信息的突触传递。

2.2 SHP2对CFA诱发的痛觉超敏的影响 实验动物分为4组:① 对照组:左后足底皮下注射生理盐水，6 h后鞘内给予5 μl的生理盐水;② CFA组:左后足底皮下注射CFA，6 h后鞘内给予5 μl的生理盐水;③ NSC-87877治疗组(0.3 μg):左后足底皮下注射CFA，6 h后鞘内给予5 μl的 NSC-87877(0.3 μg);④ NSC-87877 治疗组(3 μg):左后足底皮下注射CFA，6 h后鞘内给予5 μl的 NSC-87877(3 μg)。结果显示:和对照组动物比较，CFA组动物的缩足阈值明显降低，说明痛觉超敏的形成;而和CFA组动物比较，3 μg NSC-87877治疗组动物的缩足阈值明显升高，且作用可维持至少25 min，而0.3 μg NSC-87877对缩足阈值不产生影响，提示:3 μg的NSC-87877能够明显缓解炎性疼痛症状(Fig 1B)。而在正常动物，鞘内给予3 μg NSC-87877后25 min，动物的缩足阈值和生理盐水注射组比较无改变(saline vs 3 μg NSC-87877:(3.60 ±0.64)g vs(3.32 ±1.31)g，n=5，P ＞0.05)。

2.3 SHP2对脊髓背角NMDA受体表达的影响

2.3.1 SHP2抑制剂对总蛋白含量的影响 上述实验，在行为学测试后，立即分离脊髓背角，通过免疫印迹法，检测全细胞中NMDA受体NR2B、NR2A亚基的表达，发现CFA组、NSC-87877治疗组(3 μg)动物和生理盐水组比较，NR2B、NR2A的总蛋白含量无差异(数据未显示)，提示NSC-87877不是通过调节NMDA受体的转录或翻译过程而发挥镇痛作用。

Fig 1 The distribution of SHP2 in the spinal dorsal horn and its role in inflammatory pain ±s)

2.3.2 SHP2抑制剂对突触NMDA受体表达水平的影响 另一实验，在行为学测试后，分离脊髓背角，提取富含PSD的亚细胞结构，以免疫印迹法检测PSD中NMDA受体的表达，发现和生理盐水对照组动物比较，CFA组动物NR2B亚基的突触含量升高(Fig 2A)，而NR2A的突触含量却没有变化(Fig 2B)，提示NR2B在突触中的异常表达，可能参与痛觉超敏的形成。而和 CFA组动物比较，3 μg的NSC-87877能够降低NR2B的突触含量 (Fig 2A)，同样，NSC-87877对NR2A没有明显影响(Fig 2B)，提示特异性降低NR2B在突触中的表达，可能是NSC-87877发挥镇痛作用的重要机制。

3 讨论

NR2B受体及其突触输送(synaptic trafficking)，参与学习与记忆等一系列生理、病理性过程［11］。目前发现:在NR2B亚基胞质C-末端的第1 472位，包含一个关键性的酪氨酸残基(NR2B-Y1472)［4］。Src家族酪氨酸激酶(SFKs)对NR2B-Y1472的磷酸化，被认为是决定NR2B突触含量的核心因素［4］。另一方面，NR2B-Y1472的磷酸化还与酪氨酸磷酸酶(PTPs)有关［12］;SFKs和 PTPs之间的功能平衡，可能共同维持NR2B的突触表达及其介导的突触传递。

SHP2一种非受体型酪氨酸磷酸酶［5］。SHP2的功能异常，可能是导致奴南氏综合征、白血病等的重要原因［5，8］。NSC-87877 是目前发现的为数不多的几种SHP2化学抑制剂之一［8］，它能够与SHP2的催化结构域相结合，对SHP2的半数抑制浓度为0.318 μmol·L-1，强于对其他磷酸酶如 PTP1B、HePTP等的作用，但较高浓度的NSC-87877在离体条件下对SHP1也有交叉抑制。本研究结果发现:鞘内注射低剂量的NSC-87877，能够明显缓解炎性疼痛，提示:① SHP2可能参与脊髓痛觉信息的调控;② SHP2的激活对诱发痛觉超敏至关重要;③SHP2的化学抑制剂具有明显的镇痛作用。

Fig 2 SHP2 inhibitor NSC-87877(NSC;3 μg)abolished the increase in NR2B synaptic expression induced by CFA

由于NSC-87877在缓解炎性疼痛的同时，能够特异性降低NR2B的突触表达，提示干扰NR2B的突触输送过程，可能是NSC-87877镇痛的重要机制。鉴于NR2B-Y1472的磷酸化在调节NR2B突触表达中的核心作用、以及SHP2和SFKs之间的密切关系［6］，我们推测 NSC-87877的可能作用途径在于:①直接去磷酸化NR2B-Y1472;② 通过抑制SFKs的活性，间接阻断SFKs对NR2B-Y1472的磷酸化，从而下调NR2B的突触含量。但NSC-87877的具体镇痛机制还需要进一步的深入研究。

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