ERK 1/2和p38 MAPK介导BAPTA-AM抑制RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞分化的机制研究

周四桂，袁 茜，潘雪刁，金桂芳，徐立朋

NF-κB受体活化因子配体(RANKL)又称骨保护素配体(OPGL)、肿瘤坏死因子相关性活化诱导因子(TRANCE)、破骨细胞分化因子(ODF)等，RANKL是破骨细胞(Osteocalst，OC)生成及发挥骨吸收功能必需的细胞因子［1－3］。1998 年，Lacey等［2］用重组OPG-Fc融合蛋白作免疫探针发现在鼠类骨髓单核细胞系32D上有OPG结合分子的表达，并将其克隆成功，确认为 OPG配体(OPGL)。RANKL可分为膜结合蛋白型和可溶性蛋白型，这两种类型的RANKL均可与OC前体细胞表面的RANK受体结合，从而直接刺激OC的分化［4］。

BAPTA-AM是一种细胞内的快速钙离子络合剂，从而干扰正常Ca2+的释放和重摄取，阻断Ca2+信号转导通路［5］，由于PKC作为一种依赖于Ca2+的激酶，其活性也可被BAPTA-AM抑制。目前有关BAPTA-AM与破骨细胞的关系研究尚不完全清楚。为了观察BAPTA-AM对RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞的影响，本实验在M-CSF和RANKL两种细胞因子共同存在的条件下，建立体外骨髓诱导破骨细胞培养体系，观察BAPTA-AM对破骨细胞分化的影响，并以ERK1/2和p38MAPK为靶点进一步探索其发挥抑制作用的信号通路机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级4周龄，♀小鼠8只，体质量(19±3)g，广东省医学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基和胎牛血清(FCS)购于美国Gibco公司;M-CSF和rhsRANKL均购于英国PeproTech公司;BAPTA-AM和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒均购于 Sigma-Aldrich公司;抗 ERK 1/2、p-ERK 1/2、p38MAPK 和p-p38MAPK均购于Cell Signaling Technology公司。

1.3 破骨细胞的分离和培养方法 用蒸馏水冲洗鼠体后拉颈脱位处死，75%乙醇浸泡5 min。无菌条件下分离股骨及肱骨，剪断两侧骨骺端，用注射针头将 RPMI 1640(含100 kU·L－1青霉素，100 mg·L－1链霉素，2 mmol·L－1L-谷胺酰氨，10%FCS)轻轻冲洗骨髓腔，吸取上层细胞悬液，以1×108·L－1的浓度均匀接种于24孔培养板中，每孔加全培养液至1 ml，37℃、5%CO2环境中培养。实验根据培养液中是否加入 M-CSF(50 μg·L－1)、RANKL(50 mg·L－1)和不同浓度的BAPTA-AM分组。将分组的细胞混合液移入培养板中并放入培养箱(5%CO2、37℃)中培养，每隔2 d换液1次，培养过程中每天定期观察细胞的形态和生长状态。于d 5～d 7进行细胞观察、计数及生化指标测定。

1.4 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 将细胞玻片固定后，按试剂盒说明进行操作，中性树胶封片，光镜下观察。以TRAP+多核细胞(≥3)为破骨细胞，对每个玻片随机取5～10个视野(×200)中的破骨细胞数进行计数。

1.5 免疫印记法(Western blot)检测p-ERK 1/2和p-p38MAPK的表达 细胞经实验因素处理后，离心收集。使用冰冷的PBS洗涤细胞3次，加入裂解缓冲液(50 mmol·L－1Tris-HCl，150 mmol·L－1NaCl，0.2 g·L－1NaN3，1 g·L－1SDS，1.0 mmol·L－1PMSF，1 mg·L－1aprotinin，1.0 g·L－1NP40，5.0 g·L－1Na3VO4，1 mg·L－1leupeptin，pH 8.0)振荡混匀，冰浴30 min，4℃ 12 000×g离心10 min，取上清，即为胞质蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。调整样品的蛋白量进行SDS-PAGE，将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜上。PBST洗膜5 min。室温下用5%脱脂奶粉(PBST溶解)封闭PVDF膜1 h。随后加入抗 ERK 1/2、p-ERK 1/2、p38MAPK、p-p38MAPK(1 ∶1 000)或抗 β-actin(1∶2 000)4℃孵育过夜。PBST洗脱3次，加入相应的二抗，孵育1 h，漂洗3次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，暗室中曝光到X光片上，凝胶成像系统扫描分析结果。

2 结果

2.1 破骨细胞活体观察 由Fig 1可以看出，培养1 h后开始出现贴壁细胞，大多为体积较小的单核圆形细胞，大小基本一致，分布比较均匀;培养d 2细胞形态开始出现变化，出现散在的大型细胞，局部出现细胞聚集，但各组细胞密度未见明显变化;细胞培养d 3～d 4，各组不规则细胞数量增加，体积增大，形态演变为大圆形、花瓣形等，有些细胞出现伪足，胞质内可见多核，成为破骨细胞;培养d 7破骨细胞形成逐渐达到高峰，细胞核大多有3个或3个以上。

Fig 1 The observation of mouse BMMs or osteoclasts(200×)

2.2 BAPTA-AM对小鼠骨髓巨噬细胞分化的影响 用M-CSF、RANKL和加入不同浓度BAPTA-AM(0.5、1 和 2 μmol·L－1)的 RPMI 1640 培养液培养骨髓巨噬细胞7 d，收集诱导分化的骨髓巨噬细胞，分别计数TRAP阳性细胞核数在3～10或＞10的细胞数目进行统计分析。结果显示含有RANKL的阳性对照组骨髓巨噬细胞胞质内可见多核，分化成为破骨细胞。不同浓度的BAPTA-AM对破骨细胞的形成具有明显的抑制作用，且随着浓度剂量依赖性地降低 TRAP 阳性细胞数目，2 μmol·L－1BAPTAAM能使骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞的数量较对照组明显降低(P＜0.01)，见Fig 2。

Fig 2 The effect of BAPTA-AM on the osteoclastogenesis of BMMs(n=3)

2.3 BAPTA-AM对RANKL诱导的小鼠破骨细胞存活的影响 Fig 3结果显示，与对照组相比，RANKL能明显地诱导小鼠骨髓细胞分化为成熟的破骨细胞(P＜0.05)，而与RANKL组相比，BAPTAAM能明显地抑制RANKL诱导的小鼠破骨细胞存活(P＜0.05)。

Fig 3The effect of BAPTA-AM on osteoclast survival±s，n=3)Mouse osteoclasts were treated with 2 μmol·L －1BAPTA-AM or vehicle.The medium was then changed and osteoclasts were incubated with RANKL(100 μg·L－1)or vehicle at 37℃ for 24 h.The number of osteoclasts per dish at 24 h was expressed as a percentage of the initial number of osteoclasts in the same dish.Osteoclast survival was significantly greater in cultures treated with RANKL alone than under all other conditions(P＜0.05).*P ＜0.05 vs control.#P ＜0.05 vs sample treated with only RANKL

2.4 BAPTA-AM对RANKL诱导的小鼠破骨细胞ERK1/2和p38MAPK磷酸化的影响 为了探讨BAPTA-AM对RANKL诱导的小鼠破骨细胞形成和存活的机制，我们从ERK1/2和p38MAPK信号通路来研究BAPTA-AM对其磷酸化水平的影响，Fig 4结果显示，RANKL处理能明显地诱导小鼠骨髓细胞胞质ERK1/2和p38MAPK的磷酸化(P＜0.01)。而与 RANKL组相比，BAPTA-AM能明显地抑制RANKL诱导的胞质ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平，并随着浓度增加这种抑制作用更加明显。

3 讨论

Fig 4 Effect of BAPTA-AM on ERK1/2 and p38MAPK phosphorylation stimulated by RANKL(n=3)Protein extracts were prepared after treatment with/without 12.5，25 and 50 μmol·L －1BAPTA-AM for 1 h before incubation with 25 μg·L －1RANKL for 8 h.Immunoblotting assays were performed with an antibody against phosphorylated ERK1/2(p-ERK1/2)，phosphorylated p38 MAPK(p-p38 MAPK)，ERK1/2 and p38 MAPK.In the RANKL alone treatment，the expression of p-ERK1/2 and p-p38 was higher than that of control，and BAPTA-AM inhibited RANKL-induced ERK1/2 and p38 phosphorylation dose-dependently.＊＊P ＜0.01 vs control.##P ＜0.01 vs sample treated with only RANKL

正常骨代谢过程是一种骨吸收和骨形成的动态平衡过程，这一过程受到体内外许多因素的调控，如年龄、性别、营养状况、生活习惯、疾病等。这些方面一旦出现问题，均会导致骨代谢受阻，引发骨质疏松，其本质在于骨重建过程紊乱，即破骨细胞介导的骨吸收大于成骨细胞介导的骨形成。破骨细胞来源于骨髓造血干细胞的单核巨噬细胞系，其分化过程中涉及 NF-κB活化受体(RANK)/骨保护素(OPG)/RANK配体(RANKL)系统的调节。RANKL表达于成骨细胞表面与破骨细胞前体细胞表面的RANK结合，与巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)一起启动破骨细胞的分化。研究表明M-CSF和RANKL是破骨细胞形成、分化和成熟过程中所必须有的两种细胞因子［4］。本实验在原有破骨细胞骨髓诱导培养体系的基础上，成功建立了以M-CSF和RANKL为共同诱导分化因子的破骨细胞培养体系，在这种培养体系中破骨细胞的形态和生长变化符合破骨细胞特点。

BAPTA-AM是一种细胞内的快速钙离子络合剂，从而干扰正常Ca2+的释放和重摄取，阻断Ca2+信号转导通路［5－6］。本实验结果显示，RANKL 诱导的小鼠骨髓巨噬细胞胞质内可见多核，分化成为破骨细胞。不同浓度的BAPTA-AM对破骨细胞的形成具有明显的抑制作用且随着浓度增加明显地降低TRAP阳性细胞数目。为了进一步探讨BAPTA-AM对RANKL诱导的小鼠破骨细胞形成和存活的机制，我们从ERK1/2和p38MAPK信号通路［7］来研究BAPTA-AM对其磷酸化水平的影响。ERK1/2和p38MAPK是MAPK信号传导通路中经典的信号蛋白分子，MAPK是一类由脯氨酸介导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过Ⅷ区域苏氨酸、酪氨酸双位点磷酸化活化，激活的MAPK通过磷酸化多种转录因子、细胞骨架蛋白、其它酶类等不同底物来调节多种细胞生理过程，其中ERK主要通过Ras→Raf→MAPK/ERK 激酶(MAPK/ERK kinase，MEK1/2)被激活，可能与生理性信号传导有关，促进细胞的增殖，有利于损伤的修复和细胞的再生，对破骨细胞的形成、生存、分化及刺激骨吸收有重要作用。而p38MAPK则主要参与伤害性应激信号的传导，与破骨细胞的生成和凋亡有关［8－9］。其主要通过P21激活蛋白激酶(P21-activated kinase，PAK)→混合谱系激酶 (mixed lineage kinase，TAK/ASK/MLK)→MKK3/MKK6被激活。实验结果显示RANKL处理能明显地诱导小鼠骨髓细胞胞质ERK1/2和p38MAPK的磷酸化。而与RANKL组相比，BAPTAAM能明显地抑制RANKL诱导的胞质ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平，并随着浓度增加这种抑制作用更加明显。说明Ca2+释放形成的Ca2+信号在RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞分化成为破骨细胞中起着重要作用，促进了胞质 ERK1/2和p38MAPK 的磷酸化水平［10－12］。

综上所述，Ca2+信号通路在RANKL诱导的小鼠破骨细胞形成和存活过程中起着至关重要的作用，BAPTA-AM作为一种快速高效的Ca2+络合剂，明显地抑制RANKL诱导的胞质ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平，在体外可有效地抑制破骨细胞的形成与分化，延缓骨吸收过程。

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