不同地理种群栗瘿蜂的mtDNA的16S rRNA基因部分序列及其系统进化关系分析

范 斌,贺一原,朱道弘,2

(1.中南林业科技大学昆虫行为与进化生态学实验室，中国 长沙 410004；2.湖南第一师范学院，中国 长沙 410205)

栗瘿蜂(DryocosmuskuriphilusYasumatsu)属膜翅目(Hymenoptera)瘿蜂科(Cynipidea)栗瘿蜂属，每年发生1代，主要危害板栗(Castaneamollissima)，也危害茅栗(C.sequinii)和锥栗(C.henryi)．被害枝不能抽发新梢，严重时枯死，不仅影响当年生长和结果，而且影响次年的产量，是危害我国栗树生长和结果的主要害虫之一．该虫分布于陕西、湖北、湖南、福建等我国大部分板栗产区，日本、朝鲜等国也有报道[1-3]．

线粒体DNA(mitochondrial DNA， mtDNA)是核外DNA，由于它具有分子结构稳定，母性遗传、替换速率相对快及缺少重组等特征，已成为昆虫分子系统学常被选择的研究对象[4]．对于栗瘿蜂而言，因为其特殊的生殖机制(孤雌生殖)，使得栗瘿蜂线粒体DNA成为其进化研究中一种有用的分子标记．而16S rRNA基因又是线粒体上进化速率中等的基因，适合于较高分类单元的系统发育进化的研究．目前，国内对栗瘿蜂研究主要集中在生活史、发生规律和防治策略等方面，而分子水平研究尚未见报道．本研究以栗瘿蜂线粒体内16S rRNA基因作为分子标记，对福建福州、湖南怀化、山东泰安、河北保定、湖南浏阳、广西桂林6个栗瘿蜂地理种群的线粒体DNA进行了序列测定和分析，为我国栗瘿蜂的分子进化提供理论依据．

1 材料和方法

1.1 材料

实验所用栗瘿蜂的虫瘿分别于2005年7月采自福建福州、湖南怀化、山东泰安、河北保定，2009年7月采自湖南浏阳、广西桂林．采集的虫瘿于实验室置于养虫笼(40 cm×40 cm×20 cm)内保存，成虫羽化当日收集的成虫以无水乙醇浸泡，于-20 ℃的冰箱保存备用．

1.2 样品DNA的提取

栗瘿蜂1个体置于装有100 μL STE 缓冲液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)的Eppordef管(1.5 mL)内，将其充分捣碎．加质量分数为10%的SDS溶液10 μL，并加2 μL蛋白质分解酶K(20 g/L)，以快速混匀器(XL96-B)混匀，置于电热恒温水浴锅(DK-98-1)内，37 ℃水浴30 min．加100 μL PCL (苯酚、氯仿、异戊醇体积比为 25∶24∶1)进行抽提，台式离心机(TG16-WS)离心10 min，转速为5000 r/min(下同)；提取上清液，再加100 μL PCL二次抽提，并二次离心(10 min)．离心后的抽提液加入10 μL NaAc(3 mol/L)和250 μL无水乙醇，-20 ℃过夜．过夜后的样品以落地式冷冻离心机(J-25)低温(5 ℃)离心20 min，转速为14 000 r/min(下同)；去上清液，用体积分数为75 %的冷无水乙醇洗涤后再低温离心20 min，去上清液并常温干燥．所得的DNA样品加50 μL TE 缓冲液，于4 ℃过夜，-20 ℃保存备用．

1.3 PCR扩增

PCR扩增的上游、下游引物分别为：

5-TRACTGTRCAAAGGTAGC-3；

5-TTAATTCAACATCGAGGTC-3[5](上海生工生物有限公司合成)

PCR反应体系为50 μL，其中10×Buffer(10 mmol/L)5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，上下引物(10 μmol/L)各1 μL，Taq 酶(2.5 mol·min-1·L-1)1 μL，DNA 1 μL，双蒸水补足50 μL．扩增条件为96 ℃预变性3 min，接着进行35个热循环：96 ℃变性15 s，49 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循环完成后在72 ℃延伸10 min．扩增产物用质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶于0.5×TBE 缓冲液中电泳，电压70 V，电泳时间约1 h．电泳后以溴化乙锭(EB)染色30 min，经凝胶成像系统检测并拍照．DNA 分子量采用佳和生物科技有限公司的Mark DL2000标记．每次PCR扩增均设双蒸水的阴性对照．

1.4 16S rRNA基因序列测定和分析

扩增产物经凝胶成像系统检测后，将PCR产物送北京天根生化科技有限公司纯化回收，进行双向测序，以确保序列的可靠性．使用Clustal X 1.81软件对所得栗瘿蜂线粒体16S rRNA基因序列进行排列比对，然后将序列在NCBI中用BLAST进行相似性搜索，确定扩增的片段为目标基因序列．利用Mega 4.0中的双参数模型计算各种群的遗传距离，以落叶松种子小蜂(EurytomalaricisYano)为外群，并用邻近法(NJ)，最小进化法(ME)，非加权配对算术平均法(UPGMAN)重建系统进化树，系统进化树中结点的自举检验置信度以1 000次自导复制计算估计．

2 结果

2.1 PCR扩增结果

从图1可见，栗瘿蜂16S rRNA的PCR扩增产物经凝胶电泳检测后，大约在430～470 bp之间，为实验扩增的目的基因范围，且条带清晰无杂带，选取亮而且清晰的条带纯化后测序．

2.2 6个不同地理种群的栗瘿蜂16S rRNA基因序列比较

经Mega4.0软件分析得出，保定种群、泰安种群、浏阳种群、福州种群、桂林种群、怀化种群这6个种群的差异非常明显，碱基的缺失、插入、转换和颠换现象严重．

2.3 6个不同地理种群的栗瘿蜂16S rRNA基因序列组成分析

综合从NCBI检索获得的其他栗瘿蜂科中枝跗瘿蜂(Ibalia)的16S rRNA基因序列进行比对，同源性达80%以上，说明所得序列为栗瘿蜂科16S rRNA基因序列．利用Mega 4.0软件统计出这6个不同地理种群的栗瘿蜂16S rRNA基因序列间变异位点和A、T、C、G的平均含量．其中，保守位点(C)88个，变异位点(V)270个，简约信息位点(Pi)155个，自裔位点(Si)15个，分别占24.6%、75.4%、43.3%、32.1%．T、C、A、G碱基平均含量分别为42.6%、8.1%、41.5%、7.8%，其中(A+T)含量(84.1%)明显高于(C+G)含量(15.9%)．

2.4 6个不同地理种群的栗瘿蜂16S rRNA基因碱基转换/颠换数及遗传分析

根据16S rRNA基因序列，通过Mega4.0软件分析出6个不同地理种群的栗瘿蜂的遗传距离为0.168 4～0.538 7，平均遗传距离为0.398 0．由表1可以看出桂林和怀化种群间的遗传距离最小(0.168 4)，亲缘关系最近；浏阳和桂林种群间的遗传距离最大(0.538 7)，亲缘关系最远．整个部分序列中，核苷酸的转换/颠换(TS/TV)平均值为0.4，替换以颠换为主，并且各序列变异位点颠换多于转换(表1)．

表1 目的基因16S rRNA的序列转换/颠换数与遗传距离

注：对角线上三角的数据为转换/颠换数，对角线下三角的数据为遗传距离.

当转换/颠换比值小于2.0时，此基因序列突变达到饱和状态，受进化噪音的影响可能性较大[6]．本研究中的6个地理种群的转换/颠换比平均值为0.4，说明栗瘿蜂的突变已经达到了饱和状态，在重建系统树时受饱和效应的影响也越大．为了避免碱基替换饱和分析对系统进化树分析的影响，本文以遗传距离为横坐标，转换数和颠换数为纵坐标进行散点分析(图2)．分析结果显示，颠换的数值明显高于转换的数值，随着遗传距离的增大，颠换数增加的速度大于转换数，且转换数趋于稳定，而颠换数呈直线上升的趋势．转换和颠换的比率随着遗传距离的增加也并未出现饱和状态，而是呈稳定性的线性增长，因此，在分析中将所有的转换和颠换信息应用于系统进化树的构建．

M:Marker2000；1:保定；2:泰安；3:浏阳；4:怀化； 5:福州；6:桂林；7:阴性对照图1 栗瘿蜂6地理种群16S rRNA基因的PCR扩增 图2 栗瘿蜂6地理种群碱基替换饱和分析

2.5 6个不同地理种群的栗瘿蜂16S rRNA分子系统进化树

利用Mega 4.0中的双参数模型分析，以落叶松种子小蜂(EurytomalaricisYano)为外群，用邻近法(NJ法)，最小进化法(ME)，非加权配对算术平均法(UPGMAN)重建系统进化树，系统进化树中结点的自举检验置信度以1 000次重复估计计算 (图3～图5)．

图3 基于16S rRNA基因序列构建不同地理种群的栗瘿蜂的NJ树

图4 基于16S rRNA基因序列构建不同地理种群的栗瘿蜂的ME树

图5 基于16S rRNA基因序列构建不同地理种群的栗瘿蜂的UPGMAN树

利用NJ、ME、UPGMAN分析得到的分子系统发育树拓扑结构基本一致，6个不同地理种群大致可以分为两个支系，第一个支系由保定、浏阳、泰安种群组成，并有着极高的置信度(100%)，说明这三者之间具有较近的亲缘关系；第二个支系由福州、桂林、怀化种群组成，前期已经出现分化，且置信度相对较低．从总体上看，这6个地理种群在聚类上呈现出一种平行式的分布关系，并没有因为地理环境的远近而显示出相应的差异性，如空间位置相距较远的浏阳和泰安种群并不一定存在大的差异，而较近的怀化和浏阳种群的差异反而更加显著．

3 结论与讨论

mtDNA 16S rRNA既具有保守性，又具有高变性．保守性能够反映出物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索，高变性则能揭示出物种的特征核苷酸序列，是属种鉴定的分子基础．目前国内外对昆虫16S rRNA的报道较多，但对栗瘿蜂的16S rRNA研究还尚未见报道，而对栗瘿蜂的研究又主要集中在对其生物学特性、发生和防治等方面，如任淑艳[7]，黄汉杰[8]等；在分子水平上的研究也仅见于贺一原[1-2]和朱道弘[1-2]对栗瘿蜂的Wolbachia感染研究．国外对瘿蜂科的其他种研究较多，如Dowton M.[9]对枝跗瘿蜂(Ibalia)16S rRNA的研究，Buennige M.[10]对食榕小蜂(Sycophila)的研究等．本研究对我国栗瘿蜂线粒体DNA 16S rRNA基因序列测定和分析，在一定程度上能为栗瘿蜂的系统演化提供分子生物学方面上的证据．

对基因序列进行分析，结果表明，T、C、A、G碱基平均含量分别为42.6%、8.1%、41.5%、7.8%，其中(A+T)含量(84.1%)明显高于(C+G)含量(15.9%)，表现出明显的A+T碱基偏嗜，且A和T碱基含量相当，这与Simon[11]等报道的昆虫线粒体基因的碱基组成特征基本一致．本文所示的6个不同地理种群的栗瘿蜂16S rRNA基因片段中具有较多的转换、颠换、插入和缺失现象，这可能是由于16S rRNA基因是一非编码蛋白基因，在进化中所受到的选择压力相对较小的缘故[12]．

尽管建树方法的设置参数不同，但是，这6个不同地理种群的分化趋势大致相同，即：泰安、保定、浏阳种群亲缘关系较近，福州、桂林、怀化种群分化程度较高．分化原因可能与栗瘿蜂的生活习性相关，因栗瘿蜂的迁飞能力弱，很难远距离的转移，在地理隔离的作用下，栗瘿蜂由于寄主、气候等外界环境因素的影响，向着适应自己环境的方向进化．另一方面，种群突变和遗传漂变也是导致遗传距离差异的重要因素．

系统拓扑树上的有些分支的置信度不是太高，许多低于70，如NJ上的保定种群和浏阳种群甚至低到49，其原因可能是所研究的序列片段太短(450左右)，不能提供足够的遗传信息[13]．另外，整个实验过程中所选择的地理种群少，并没有完全反映出我国栗瘿蜂不同地理种群的遗传分化特征，因此对我国不同地理种群的栗瘿蜂遗传分化还有待进一步探讨．

参考文献：

[1] 贺一原，朱道弘，赵吕权. ftsZ基因和16S rDNA特异引物检测栗瘿蜂体内Wolbachia感染研究[J]. 湖南师范大学自然科学学报，2007，30(2):113-115.

[2] 石淑英. 栗瘿蜂发生规律及防治技术研究进展[J]. 北方园艺，1997，5(5):29-30.

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