转染杜氏盐藻 14-3-3基因对食管鳞癌 EC9706细胞 Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响＊

魏 攀,李 杰,王莉莉,许培荣,薛乐勋

郑州大学生物系细胞生物学研究室 郑州 450001

#通讯作者,男,1944年生,本科,教授,研究方向:肿瘤标志物与基因工程,E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

W EI Pan,L I Jie,WANG Lili,XU Peirong,XUE Lexun

Laboratory for Cell B iology,Departm ent of B iology,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

转染杜氏盐藻 14-3-3基因对食管鳞癌 EC9706细胞 Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响＊

魏 攀,李 杰,王莉莉,许培荣,薛乐勋#

郑州大学生物系细胞生物学研究室 郑州 450001

#通讯作者,男,1944年生,本科,教授,研究方向:肿瘤标志物与基因工程,E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏盐藻;14-3-3基因;食管鳞癌;Bcl-2;Caspase-9

目的:探讨转染杜氏盐藻 14-3-3基因对食管鳞癌 EC9709细胞 Bcl-2和 Caspase-9蛋白表达的影响。方法:将杜氏盐藻 14-3-3基因 cDNA序列分别亚克隆入表达载体 pEGFP-C1和 pcDNA3.1(+)的 HindⅢ和 BamHⅠ位点,构建真核表达载体 pEGFP-C1-14-3-3和 pcDNA3.1(+)-14-3-3,采用脂质体方法转染 EC9706细胞,同时设立空载体对照和空白对照,荧光显微镜观察 pEGFP-14-3-3融合蛋白在 EC9709细胞中的定位;G-418筛选稳定转染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的细胞株,采用 RT-PCR和Western blotting法检测 14-3-3基因的表达;Western blotting检测 3种细胞中 Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表达。结果:pEGFP-14-3-3融合蛋白定位于 EC9706细胞的细胞核;通过 G-418筛选,最终获得稳定表达盐藻 14-3-3基因的转染细胞株;与转染空载体和空白对照的 EC9706细胞相比,转染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的 EC9706细胞中 Bcl-2蛋白表达量明显增高 [(1.60±0.20)、(0.90±0.15)和 (2.40±0.10);F=69.889 7,P<0.001],而 Caspase-9蛋白表达量明显降低 [(1.00±0.04)、(1.40±0.08)和 (0.40±0.05);F=217.066 7,P<0.001]。结论:杜氏盐藻 14-3-3基因可能在 EC9706细胞凋亡过程中发挥了抑制作用。

W EI Pan,L I Jie,WANG Lili,XU Peirong,XUE Lexun

Laboratory for Cell B iology,Departm ent of B iology,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

14-3-3蛋白是一种纤毛相关蛋白,可与癌基因或原癌基因产物结合参与细胞信号传导,通过与极性蛋白 CRB3结合,维持极性蛋白的正确定位和纤毛的正常组装[1-2]。有研究[3]报道,参与纤毛 /鞭毛组装和调控的基因异常能引起许多人类遗传性疾病,但其与肿瘤发生的关系目前还不清楚。关于纤毛组装和调控的研究主要依赖于单细胞真核生物,鞭毛内运输机制最早在双鞭毛衣藻中得到证实[4]。杜氏盐藻细胞与衣藻细胞相比在结构上无细胞壁,同时还具有一对等长的鞭毛,具有典型的 9+2结构。以上特点使杜氏盐藻鞭毛有望成为研究人类纤毛疾病的模式细胞器。课题组最近克隆了杜氏盐藻鞭毛相关基因 14-3-3 cDNA全长序列,蛋白 BLAST结果显示与人类相应蛋白同源性高达 80%[5-6]。作者将杜氏盐藻 14-3-3基因转染食管鳞癌 EC9706细胞株,观察其在细胞中的定位以及其对 EC9706细胞中 Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 杜氏盐藻 (LB1644,Dunaliella salina,美国德州大学),食管鳞癌 EC9706细胞株 (中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠),pEGFP-C1和 pcDNA3.1(+)载体 (大连宝生物工程公司),PCR引物 (上海生物工程技术服务有限公司合成),RPM I 1640培养基、胎牛血清和胰蛋白酶 (美国 Hyclone公司),β-actin多克隆抗体、Bcl-2单克隆抗体和 Caspase-9多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司 )。

1.2 方法

1.2.1 杜氏盐藻 14-3-3基因的扩增 根据 Genbank登录序列 (Genbank登录号:AY965896)设计引物:上游引物,5’-CAATAAGCTTATGCATCA TCATCATCATCATGCTGAGGCGAGAGAGGAGTG-3’(带有HindⅢ酶切位点和6个组氨酸标签);下游引物, 5 ’-GCCCGGATCCTTAGGCATCGGCCTCCTC AACCTT-3’(带有B amHⅠ酶切位点),扩增产物大小 774 bp。以杜氏盐藻 cDNA为模板进行 PCR扩增,反应条件:95℃3 min;94℃30 s,54℃40 s,72℃1 min,30个循环;72℃5 min;4℃保存。10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析 PCR结果。

1.2.2 重组质粒的构建与鉴定pEGFP-C1、pcDNA3.1(+)和盐藻 14-3-3基因目的片段同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,纯化酶切产物,将酶切后目的片段和载体片段以 3:1(物质的量的比)连接,转化感受态大肠杆菌 JM109后,挑选单个菌落并提取重组质粒,HindⅢ和 BamHⅠ双酶切鉴定,并送上海生工生物工程有限公司测序,鉴定正确的阳性重组质粒分别命名为 pEGFP2C12142323和 pcDNA3.1(+)2142323。

1.2.3 细胞培养及重组质粒转染 用含体积分数为 10%胎牛血清的 RPM I1640培养基于 37℃、体积分数为 5%CO2饱和湿度条件下培养 EC9706细胞,达到 90%～95%融合时,采用 Lipofectami2 neTM2000按说明书分别转染 pEGFP2C12142323和pcDNA3.1(+)2142323,同时设空载体对照和空白对照。

1.2.4 pEGFP2142323融合蛋白定位的荧光显微镜观察 转染 EC9706细胞 24 h后,用显微荧光摄像 /照相系统检测转染细胞中 pEGFP2142323融合蛋白的表达,以蓝光激发,高倍镜 (×400)下观察。

1.2.5 稳定转染 pcDNA3.1(+)2142323细胞株的筛选和鉴定 将已转染 pcDNA3.1(+)2142323的EC9706细胞用 G2418(400 mg/L)加压筛选。每隔 2 d换液 1次,G2418含量不变,维持 3～4周。应用Trizol试剂提取转染细胞总 RNA,取 2μg总 RNA进行逆转录,PCR扩增盐藻 142323,以β2actin为内参,每组各设 3个复孔。盐藻 142323引物序列同1.2.1;β2actin上游引物:5’2GGGACCTGACTGACTACCT2 CA23’,下游引物:5’2GACTCGTCATACTCCTGCTTG2 3’。反应条件:95℃3 min;94℃30 s,54℃40 s,72℃1 min,30个循环;72℃5 min,4℃保存。PCR产物经 10 g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像,Bandscan 5.0软件进行灰度分析。用蛋白裂解液提取 3组细胞的总蛋白,用 Bradford法测定蛋白浓度。制备十二烷基硫酸钠 (SDS)2聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样量 60μg,常规电泳、转膜、封闭,用鼠抗组氨酸标签 (His tag)的抗体作为一抗 (1:200),山羊抗小鼠 IgG抗体作为二抗 (1:10 000)进行Western blotting分析,同时用β2actin作阳性对照。ECL发光液处理后暗室内曝光 X线胶片,应用 TotalLab 2.0软件进行图像的灰度分析。

1.2.6 Bcl22和 Caspase29蛋白表达的Western blot2 ting分析 用蛋白裂解液提取 pcDNA3.1(+)214232 3转染、pcDNA3.1(+)空载体转染和不转染的EC9706细胞的总蛋白,用 Bradford法测定蛋白浓度,方法同 1.2.5,Western blotting法分析目的蛋白的表达情况。

1.3 统计学处理 应用 SPSS 13.0进行统计分析,转染后 3组 EC9706细胞 Bcl22和 Caspase29蛋白表达的比较应用单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 杜氏盐藻 142323基因的扩增 PCR扩增出的DNA特异条带片段大小约为 774 bp,与预期结果相符 (图 1)。

图1 杜氏盐藻 142323基因 PCR扩增结果

2.2 重组质粒的鉴定 经 HindⅢ和 B amHⅠ双酶切鉴定及测序分析,重组质粒含有大小、方向和读码框均正确的插入片段 (图 2)。

图2 重组载体双酶切鉴定结果

2.3 EC9706细胞中 pEGFP2C12142323的定位高倍镜下 (×400)可见转染 pEGFP2C1空载体的EC9706细胞绿色荧光主要分布于胞质,胞核处可见圆形的空泡 (图 3A)。转染 EGFP2C12142323载体的EC9706细胞绿色荧光主要分布于胞核,可见明显的核仁分裂相 (图 3B)。

2.4 稳定转染 pcDNA3.1(+)2142323细胞株的筛选及鉴定结果 RT2PCR结果显示 (图 4),只有pcDNA3.1(+)2142323转染株中扩增出盐藻 142323基因片段,证明盐藻 142323基因已成功转入 EC9706细胞。Western blotting结果显示 pcDNA3.1(+)-14-3-3转染株在 25 000～32 000处有特异条带,证明 14-3-3蛋白已经表达 (图 5)。

2.5 转染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的 EC9706细胞Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表达 见表 1和图 6。

表1 转染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的 EC9706细胞 Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表达

图6 转染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的EC9706细胞Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表达

3 讨论

食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,在食管发生囊性变或癌变时,可见有大量的纤毛突出于细胞表面,而纤毛作为诸多信号传导的指令舱,在肿瘤发生中可能起重要作用[7]。衣藻和人的蛋白组学研究显示14-3-3蛋白是一类纤毛/鞭毛相关蛋白[8-9],并且Fan等[2]的研究结果也提示其定位在纤毛。作者观察到pEGFP-14-3-3融合蛋白主要在EC9706细胞的胞核部分表达,其原因可能是由于哺乳类动物细胞株在体外传代培养时,经常会引起纤毛的丢失或形成初生纤毛,而细胞核是细胞的控制中心,在纤毛 /鞭毛的生成过程中具有生发点的作用。

研究[10]表明,14-3-3蛋白是细胞内的一个重要抗凋亡因子,它能与Bcl-2蛋白家族中的一个促细胞凋亡成员Bad以磷酸丝氨酸依赖性的方式相互作用,从而拮抗Bad促细胞凋亡性质,抑制细胞凋亡。Caspase家族是执行细胞凋亡的关键酶家族,Caspase-9作为其中一员,属于该家族的凋亡起始组,其活化可以激活凋亡效应组的Caspase-3和Caspase-7,从而诱导细胞凋亡。而Caspase-3和Caspase-9之间存在正反馈效应,可使细胞凋亡加速。有研究[11]表明杜氏盐藻14-3-3蛋白与细胞周期相关,是一种细胞周期依赖蛋白。作者观察到,与转染pcDNA3.1(+)空载体的细胞株相比,转染pcDNA3.1(+)-14-3-3的 EC9706细胞中Bcl-2蛋白的表达明显增加,而Caspase-9蛋白的表达明显降低,提示杜氏盐藻14-3-3基因在可抑制 EC9706细胞的凋亡,从而为食管鳞癌的分子治疗寻找到一个潜在的特定治疗靶点——利用14-3-3拮抗剂结合RNA干扰技术,通过降低14-3-3蛋白的表达水平,促进细胞的凋亡,可能为恶性肿瘤的治疗提供新的策略;同时也为开发靶向分子药物,改进食管鳞癌的治疗方法及改善食管鳞癌患者的预后,提供了可行性。

[1]QiW,Liu X,Qiao D,et al. Isoform-specific expression of 14-3-3 proteins in human lung cancer tissues[J].Int J Cancer,2005,113(3):359

[2]Fan S,Hurd T W,Liu CJ,et al.Polarity proteins control ciliogenesis via kinesin motor interactions[J].Cur Biol,2004,14(16):1 451

[3]Christensen ST,PedersenLB,SchneiderL,et al.Sensory cilia and integration of signal transduction in human health and disease[J].Traffic,2007,8(2):97

[4]Eley L,Yates LM,Goodship JA.Cilia and disease[J].CurrOpin GenetDev,2005,15(3):308

[5]姬翔,王天云,王亚峰,等.杜氏盐藻 14-3-3蛋白 cDNA片段的克隆与分析[J].郑州大学学报:医学版,2006,41(3):433

[6]王亚峰,王天云,姬翔,等.杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白 cDNA片段的克隆及序列分析[J].郑州大学学报:医学版,2006,41(3):436

[7]Takubo K,ViethM,Honma N,et al.Ciliated Surface in the esophagogastric junction zone:a precursor ofBarrett’s mucosa or ciliated pseudostratied metaplasia[J].Am J Surg Pathol,2005,29(2):211

[8]Snell WJ,Pan J,Wang Q.Cilia and flagella revealed:from flagellar assembly in Chlamydomonas tohuman obesity disorders[J].Cell,2004,117(6):693

[9]Sekimoto T,Fukumoto M,Yoneda Y.14-3-3 suppresses the nuclear localization of threonine 157-phosphorylated p27(kip1)[J].EMBO J,2004,23(9):1 934

[10]Wang T,Xue L,Ji X,et al.Cloning and characterization of the 14-3-3 protein gene from the halotolerant algaDunaliella salina[J].MolBiol Rep,2009,36(1):207

[11]Jia Y,Xue L,LiJ,et al.Isolation and proteomic analysis of the halotolerant algaDunaliella salinaflagella using shotgun strategy[J].MolBiol Rep,2010,37(2):711

Expression of Bcl-2 and Caspase-9 proteins of EC9706 cell transfected 14-3-3 gene ofDunaliella salina

Dunaliella salina;14-3-3 gene;esophageal squamous cell cancer;Bcl-2;Caspase-9

A im:To investigate the effect of the 14-3-3 gene ofDunaliella salinaon the expression of Bcl-2 and Caspase-9 proteins of esophageal squamous cell cancer cell line EC9706.Methods:The cDNA fragment of the 14-3-3 gene ofDunaliella salinawas subcloned into theHindⅢ-BamHⅠsites of the eukaryotic expression vector pEGFP-C1 and pcDNA3.1(+),respectively,generating recombinant expression vectors pEGFP-C1-14-3-3 and pcDNA3.1(+)-14-3-3.The recombinant vectorswere transfected into EC9706 cells byLipofectamineTM2000 at the same time,the vectorswithout 14-3-3 genes served as controls,the location of the fusion EGFP-14-3-3 proteins was determined by fluorescent microscope and the EC9706 cells transfected with pcDNA3.1(+)-14-3-3 were selected with G-418 and characterized by RT-PCR and Western blotting,then the expression of the Bcl-2 and Caspase-9 proteins in the transfectants was monitored by Western blotting.Results:pEGFP-14-3-3 fusion proteins were localized in the nucleus of EC9706 cells.EC9706 cells stably expressing the 14-3-3 gene ofDunaliella salinawere obtained with G-418 selection.The expression of Bcl-2 protein significantly increased[(1.60±0.20),(0.90±0.15)and(2.40±0.10);F=69.889 7,P<0.001]while that of Caspase-9 protein decreased[(1.00±0.04),(1.40±0.08)and(0.40±0.05);F=217.066 7,P<0.001]in the EC9706 cells transfected with pcDNA3.1(+)-14-3-3,compared with the control groups.Conclusion:The introduction of the 14-3-3 gene ofDunaliella salinaupregulates the expression of Bcl-2 protein while downregulates that of Caspase-9 protein in the EC9706 cells,suggesting its potential role in inhibiting the apoptosis of cells.

Q789

＊国家自然科学基金资助项目 30700014;科技部国际科技合作基金资助项目 2007DFA01240

(2008-12-31收稿 责任编辑 赵秋民)