抗人参皂苷 Rg3抗血清的制备

曾华金,杨 冉,刘吉华,屈凌波,余伯阳#

1)郑州大学药学院郑州 450001 2)郑州大学化学系郑州 450001 3)中国药科大学中药复方教研室南京 210038 4)河南工业大学郑州 450001

(2008-12-15收稿 责任编辑 徐春燕)

人参是我国珍贵的传统中药,具有滋补、强壮及抗疲劳等多方面的药理和生物活性。人参皂苷属于三萜类皂苷,是其主要活性成分。研究[1-2]显示,人参皂苷具有很强的抗单纯疱疹病毒的活性及抑制肿瘤浸润和转移的作用,但对肿瘤细胞本身并无细胞毒效应。作者通过构建人工抗原制备抗人参皂苷Rg3的特异性抗血清,为 Rg3的测定及药代动力学的免疫学研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、仪器与试剂 免疫实验动物为新西兰大白兔 2只,体质量约 2.5 kg,购于南京市金陵种兔场。透析袋(截取物质相对分子质量 8 000～10 000),红外分光光谱仪 (Shimadzu,Japan),F-4500荧光光谱仪(Hitachi,Japan),酶标仪(Tecan,Austria)。Rg3购于吉林大学基础医学院有机化学研究室 ,人参皂苷 Rg1、Rb1、Rg2、Compound K和Rh1均为自制,牛血清白蛋白(BSA,Amresco公司),卵清蛋白(OVA,Sigma公司),三硝基苯磺酸(TNBS,Sigma公司),高碘酸钠(NaIO4,广东西陇化工厂),硼氢化钠(NaBH4,中国医药集团上海化学试剂公司),羊抗兔辣根过氧化物酶(IgG-HRP,武汉博士德生物工程有限公司),福氏完全佐剂(FCA,上海思吉生物制品有限公司),福氏不完全佐剂(FIA,自制),其他试剂为分析纯。

1.2 人工抗原 Rg3-BSA的制备 参照文献[3],采用高碘酸盐氧化法将 Rg3与 BSA和 OVA共价偶联,分别合成免疫抗原 Rg3-BSA和包被抗原 Rg3-OVA。

1.3 人工抗原的鉴定及偶联率的测定 参考文献[4],用溴化钾将 Rg3、BSA及透析后的 Rg3-BSA制成薄片进行红外光谱鉴定。在 BSA荧光光谱最大激发波长 280 nm的激发下,对适当浓度的 Rg3、BSA、Rg3-BSA及 2者混合物(Rg3+BSA)进行荧光光谱分析。采用 TNBS法[5]测定 Rg3-BSA的偶联率,偶联率 =[DBSA(335 nm)-DRg3-BSA(335 nm)/DBSA(335 nm)]×100%×60。

1.4 抗血清的制备 免疫动物为 2只新西兰大白兔,第 1次基础免疫时,取 1 mL人工抗原 Rg3-BSA(含 1 mg的 Rg3-BSA),同时加入等体积的 FCA,用注射器来回抽拉制成乳剂。以背部多点注射法进行免疫,注射 20个点,每个点 100μL。以后每间隔 10 d加强免疫 1次,免疫量为初始剂量的 1/2,与等体积的 FIA制成乳剂,共加强免疫注射 5次。最后 1次免疫注射量为 1 mL抗原(含 1 mg的 Rg3-BSA)与等体积 FIA制成乳剂,免疫注射 7 d后,于颈动脉取全血,室温放置 1 h后转至 4℃过夜,然后 4 000 r/min离心 10 min,所得抗血清于 -70℃保存备用。

1.5 抗血清的鉴定 用方阵滴定的方法优化包被抗原和抗血清的工作浓度[6]。确定理想的包被抗原浓度后,采用间接 ELISA法测定抗体的效价。取1只兔子产生的抗血清进行抗血清特异性交叉反应实验。选择人参皂苷 Rb1、Rg2、Rh1、Rg1和 Compound K进行竞争性抑制实验,根据公式计算各自的 IC50值及交叉反应率。

2 结果与讨论

2.1 人工抗原 Rg3-BSA的鉴定 红外光谱鉴定结果见图 1。比较 Rg3-BSA与 Rg3的红外光谱发现,Rg3-BSA在 3 400 cm-1附近出现 Rg3羟基的特征峰,这与 BSA的红外光谱存在差异,证明偶联成功,Rg3-BSA可以用作免疫抗原。荧光光谱鉴定结果见图 2。Rg3-BSA荧光光谱的最大发射波长相对于BSA发生了明显的蓝移,提示蛋白质的结构发生了改变[7],因此说明蛋白质所发生的改变是由于 BSA与 Rg3分子相互结合生成了新的物质(Rg3-BSA)。Rg3-BSA的偶联率为 28,相对分子质量为 90 400。

2.2 抗血清的制备与鉴定 采用方阵滴定法,确定理想的包被抗原浓度和抗血清的工作浓度分别为1 000μg/L和 1:20 000。以免疫前血清为阴性对照,测得 2只兔子产生的抗血清的效价均为 1:51 200,见图 3。抗血清交叉反应率见表 1。可以看出,所制备的抗血清与其他人参皂苷的交叉反应率很低,小于 3%,说明抗血清的特异性强。经计算得到 Rg3的 IC50值为 2.91μg/L,表明 ELISA方法具有较高的灵敏度,适合用于人参皂苷 Rg3的微量测定与分析研究。

表 1 抗血清交叉反应率

[1]刘继华,卢丹,刘金平,等.20S-人参皂苷 Rg3眼膏在兔眼组织分布及其药代动力学[J].药学学报,2005,40(3):258

[2]王兵,王杰军,徐钧,等.人参皂苷 Rg3对胃癌诱导血管内皮细胞增殖的抑制作用[J].肿瘤防治杂志,2001,8(3):234

[3]徐玲,王冕,刘新彦,等.分光光度法测定参皇霜中人参皂苷Re的含量[J].中国新医药,2003,2(5):96

[4]曾华金,刘吉华,余伯阳.抗甘草酸二铵抗血清的制备[J].免疫学杂志,2006,22(5):570

[5]Habeeb AF.Determination of free aminogroups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid[J].Anal Biochem,1966,14(3):328

[6]李宗霆,周燮.植物激素及其免疫检测技术[M].南京:江苏科学技术出版社,1996.

[7]陶慰孙,李惟,姜涌明,等.蛋白质分子基础[M].北京:高等教育出版社,1987.