谷氨酰胺对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障的保护作用及机制

彭晶晶 陈婕 许娟娟 胡耿诚 孟庆彬 丁震 钱伟 侯晓华

·短篇论著·

谷氨酰胺对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障的保护作用及机制

彭晶晶 陈婕 许娟娟 胡耿诚 孟庆彬 丁震 钱伟 侯晓华

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)时的细菌感染主要是由于肠黏膜屏障破坏导致肠道细菌易位所致[1-2]。谷氨酰胺作为肠黏膜的重要能源物质，同时也是核苷酸合成的重要底物，能够起到保护肠黏膜屏障，增强肠道免疫功能，降低炎症介质和细胞因子释放的作用[3-5]。但其具体机制尚不清楚。本实验旨在评价谷氨酰胺灌肠对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肠黏膜屏障的保护作用，探讨其机制。

一、材料和方法

1．实验动物及分组：健康雄性SD大鼠72只，清洁级，体重200～250 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。按完全随机的方法分为假手术组、ANP组和谷氨酰胺组，每组又分术后3、6、12 h 3个时间点，各8只。ANP模型制作参照Schmidt等和许永春等的方法[6-7]；假手术组向腹腔内注射生理盐水；谷氨酰胺组在术前30 min按谷氨酰胺1 ml/kg体重灌肠。

2．胰腺组织病理学检测：按常规进行。

3．血浆TNF-α、DAO及内毒素测定：血浆TNF-α采用ELISA法，DAO(Sigma公司)采用分光光度法，内毒素采用鲎试剂显色基质法(上海伊华生物有限公司)检测。

4．回肠超微结构观察：快速取术后6 h处死的大鼠末端回肠组织，锇酸固定后，送华中科技大学同济医学院电镜中心检查。

5．回肠组织细胞间紧密连接Occludin蛋白检测：采用常规Western blotting法检测，以β-actin为内参。Occludin蛋白表达值以目的蛋白条带和β-actin条带吸光值的比值表示。

二、结果

1．胰腺组织病理学改变：假手术组胰腺未见异常； ANP组初期见胰腺间质水肿，腺泡细胞变形，少量中性粒细胞浸润，随着时间延长，腺泡小叶结构破坏，实质出血，凝固性或脂肪坏死，大量中性粒细胞和单核细胞浸润；谷氨酰胺组胰腺的上述病理性损伤明显减轻(图1)。

图1假手术组(a)、ANP组(b)、谷氨酰胺(c)组6 h时的病理改变(HE ×400)

2．血TNF-α、DAO及内毒素含量变化：ANP组的血TNF-α、DAO及内毒素含量均显著高于同时间点的假手术组(P值均<0.01)；谷氨酰胺组血TNF-α、DAO及内毒素含量均显著低于同时间点的ANP组，但仍显著高于假手术组(P值均<0.01，表1)。

表1 各组血TNF-α、DAO及内毒素的变化

注：与假手术组比较，aP<0.01；与ANP组比较，bP<0.01

3．回肠超微结构改变：假手术组大鼠回肠黏膜结构完整，细胞游离缘绒毛排列整齐，形态规则，细胞间及顶端有明显的连接复合体(图2a)。ANP组大鼠回肠黏膜微绒毛稀疏、断裂、脱落，微绒毛高度较假手术组明显缩短；细胞间紧密连接条索缩短、数量减少甚至结构模糊；回肠黏膜厚度降低(图2b)。谷氨酰胺组大鼠回肠微绒毛稍稀疏，排列尚整齐，紧密连接基本完整，微绒毛高度较ANP组增高，回肠黏膜厚度增加(图2c)。

图2假手术组(a)、ANP组(b)、谷氨酰胺组(c)6 h时的回肠超微结构(×40000)

4．回肠组织Occludin蛋白的表达：假手术组3、6、12 h时 Occludin蛋白的相对表达量分别为1.22±0.27、1.21±0.25、1.19±0.33；ANP组分别为0.20±0.07、0.21±0.05、0.16±0.08；谷氨酰胺组分别为0.64±0.10、0.55±0.08、0.59±0.08。ANP组较假手术组均显著减少(P值均<0.05)，而谷氨酰胺组较ANP组均显著增加，但仍显著低于假手术组(P值均<0.05，图3)。

1、2、3：谷氨酰胺3、6、12 h组；4：假手术组；5、6、7：ANP 3、6、12 h组

图3肠黏膜Occludin蛋白免疫印迹

讨论TNF-α是急性胰腺炎的始动因子之一[8]。文献报道，血清TNF-α在大鼠ANP诱导后1 h就明显升高,随后在6 h内急剧上升,并与胰腺损伤和炎症的严重程度密切相关,可作为早期评估胰腺炎症程度的指标之一[9]。肠黏膜屏障主要由肠黏膜机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障四部分组成，其中由肠道黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接(tight junction，TJ)构成的肠黏膜机械屏障是肠屏障功能的最主要组成部分之一,能有效阻止细菌穿透黏膜进入深部组织[10-11]。Occuldin是TJ中最重要的结构蛋白之一，是肠黏膜通透性调节的一个关键环节[12]。血清DAO含量是评价创伤和应激情况下肠黏膜屏障功能障碍的理想指标之一[13]。肠屏障功能障碍,导致细菌和(或)内毒素易位，可形成肠源性内毒素血症。因此，Occuldin表达、血DAO及内毒素水平均是反映肠黏膜屏障的指标。

本实验结果显示， ANP大鼠血TNF-α水平在早期即明显升高， 6 h达峰值。同时，血DAO、内毒素水平明显升高，回肠黏膜Occludin蛋白表达明显下降。预防性应用谷氨酰胺灌肠后，大鼠血TNF-α、DAO及内毒素水平均较ANP大鼠显著降低，回肠黏膜Occludin蛋白的表达明显增加，但仍较假手术组高，提示谷氨酰胺能在一定程度上改善肠黏膜屏障的损伤程度。通过对回肠黏膜超微结构的观察，谷氨酰胺灌肠的大鼠肠黏膜微绒毛高度较ANP大鼠明显增高，密度也增加，进一步从形态学上证实谷氨酰胺对肠黏膜的保护作用。表明谷胺酰胺可能通过上调肠黏膜Occuldin蛋白表达，改善肠黏膜机械屏障,进而减轻了内毒素血症，为其临床应用提供了新的途径和实验证据。

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2009-08-05)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.025

430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科

陈婕，Email:jichen07@yaho.com