survivin在结直肠癌中表达及与临床病理特征的关系

河北北方学院附属第二医院普外科(张家口 075100)

鲁 蓓 武 欣* 王琳冬△ 王淑强* 范 婕* 左东升* 白美玲* 张林西▲

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一。近年来,其发病率有明显升高、发病年龄提前的趋势。凋亡是正常体细胞维持自稳的重要保护机制之一。近年来发现,凋亡蛋白家族抑制因子重要成员之一survivin,在成人组织中无表达,而在人类多数恶性肿瘤组织如食管癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等[1～4]中高表达,并能强烈抑制细胞死亡。本研究采用流式细胞术及免疫组织化学方法检测结直肠癌(Colorectal carcinoma,CRC)及结直肠正常黏膜中 survivin的表达情况,并分析其表达与结直肠癌各种病理参数之间的关系,探讨其在结直肠癌进展和转移中的作用,为结直肠癌浸润和转移的预测、预后判断提供理论依据。

材料和方法

1 临床资料 收集河北北方学院医学院病理学教研室以及河北北方学院附属第一医院2005年3月至2006年5月间手术切除的结直肠癌标本 100例,同时选取结直肠癌远端病理证实组织学正常的黏膜 11例。患者术前均未经过放、化疗,且术后病理均确诊为腺癌。其中,男性 41例,女性 59例,年龄 30～78岁,平均年龄58.3岁。发生部位:结肠癌46例,直肠癌54例;组织分化程度:高分化腺癌 52例,中分化腺癌 26例,低分化腺癌 11例,粘液腺癌 11例;有淋巴结转移组 48例,无淋巴结转移组 52例。连续切片,厚4μm,取 2～3张切片,其中 1张做常规 HE染色,由两位资深病理医师进行病理诊断复查。另一张用于免疫组化 S-P法检测 survivin蛋白表达。同时切40μm厚的组织片 5片,放入10ml的试管中,用于进行流式细胞术检测。

2 主要试剂 兔抗人survivin多克隆抗体(Santa Crus)、羊抗兔IgG-FITC(Lab vision Neomarkers公司产品)、SP-9000试剂盒及DAB显示剂等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

3 流式细胞术检测 首先制备合格的单细胞悬液,按[5]方法进行。然后进行细胞survivin表达的间接免疫荧光标记:取单细胞悬液 1×106/ml,加入兔抗人COX-2单克隆抗体工作液 0.lml,室温孵育 30min,加入PBS10ml洗涤一次,弃上清,加入羊抗兔 FITC-IgG二抗工作液 100μl,避光室温孵育 30min,加入PBS 10ml离心同上,弃上清以除去未结合的荧光二抗,上机检测前加入PBS 0.1ml经500目铜网过滤后上机检测。同时设一抗或二抗的本底对照和阴性对照。采用美国Beckman Coulter公司生产的Epics-XL II流式细胞仪进行检测,应用 Expo 32 ADC软件进行免疫荧光数据分析。检测前调整仪器 CV值在 2%以内。

4 survivin蛋白免疫组化 S-P法染色 石蜡切片,常规脱蜡至水。按常规S-P法进行染色,survivin一抗进行 1∶100稀释。DAB显色,镜下观察显色结果,待阳性部位出现特异性显色时,自来水充分冲洗,终止显色。苏木素复染,充分水洗,常规梯度酒精脱水,二甲苯透明、中性树胶封片。以 PBS液代替一抗作为阴性对照,以已知结直肠癌阳性切片作为阳性对照。

5 结果判定(1)由两位资深病理医师进行双盲阅片。survivin阳性反应为胞膜及胞浆的棕黄色染色。综合染色强度和阳性细胞所占的百分比作为判断标准[6],在 400倍视野下计数 500个细胞,其中染色深度以多数细胞的呈色反应为准:浅棕色1分,棕黄色2分,深棕色 3分,不着色 0分;再将染色阳性细胞的百分比打分:阴性为0分,阳性细胞≤10%为1分,11%～50%为2分,51%～75%为3分,＞75%为4分,染色强度和阳性百分比的乘积＞3分认定为免疫反应阳性。(2)survivin表达流式细胞术定量分析:以流式细胞仪分析软件给出的每例样品的平均荧光强度计算荧光指数(Fluorescenceindex,FI),并以荧光指数表示 survivin基因蛋白表达的强弱,并进行相关的数据分析。FI计算公式为:FI=(样品基因蛋白表达荧光强度-正常样品的荧光强度)/正常样品的荧光强度。

6 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行统计分析。survivin蛋白表达的免疫组化结果进行χ2检验。survivin蛋白表达的流式细胞仪检测结果进行单因素方差分析。当P＜0.05时认为具有显著统计学差异。

结 果

1 survivin在结肠癌和正常结肠黏膜中的表达及与临床病理特征的关系 免疫组化显示survivin的阳性表达为癌细胞胞浆出现明显棕黄色。11例正常黏膜全部呈阴性;100例结直肠癌中68例呈阳性,阳性率为68.00%;两组间survivin的表达有明显差异(P＜0.05)(见表1)。淋巴结转移组survivin表达阳性率为87.50%(42/48),无转移组阳性率为50.00%(26/52),无转移组阳性率显著低于转移组(P＜0.05);survivin的表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位以及分化程度无统计学意义(P＞0.05)(见 表2)。

表1 survivin在结肠癌和正常结肠黏膜中的表达[n(%)]

表2 免疫组化检测survivin表达与临床病理特征的关系[n(%)]

表3 流式细胞术检测survivin表达与临床病理特征的关系

2 流式细胞术检测survivin表达与临床病理特征的关系 FCM结果显示,survivin在结直肠癌中表达的FI值等于3.25±1.06,其表达明显高于正常黏膜(FI值=1.00±0.25)。淋巴结转移组 survivin蛋白表达平均 FI值为3.11±1.19,显著高于无淋巴结转移组的2.26±1.38,两组间存在显著差别(P＜0.05);高、中、低分化及粘液癌组的survivin蛋白表达平均 FI值分别为3.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48和3.31±1.06,四组间无显著差别(P＞0.05)(见表3);正常黏膜组survivin蛋白表达分别与其它各组间存在显著差异(P＜0.01)(见表4)。survivin蛋白的表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位无统计学意义(P＞0.05)。

表4 流式细胞术检测 survivin在结肠癌与正常黏膜的表达

讨 论

结直肠癌是我国消化道最常见的恶性肿瘤之一,肿瘤浸润和转移是患者死亡的重要原因。survivin蛋白除与抑制凋亡和保护细胞存活外,还参与肿瘤血管形成,对肿瘤的浸润、转移等有关。1997年Sheehan等[7]从人类基因组文库中通过杂交筛选获得。survivin是凋亡抑制基因,属于凋亡蛋白抑制家族,它定位于染色体 17q25,是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中最小的成员。一般而言,survivin除了在胚胎和胸腺中有微弱表达外,其他组织均未检测到,但 survivin在几乎所有的人类癌组织中都有表达。survivin在肿瘤细胞的定位不同,功能不同。位于胞浆中主要与凋亡有关,而位于核中的survivin多与肿瘤细胞的增殖有关[8,9]。本研究应用免疫组化检测发现,其主要位于细胞浆中,而细胞核没有明显表达。说明其在结肠癌发生及进展中可能主要起到抑制凋亡的作用。

survivin作为近年来发现的一个重要凋亡抑制因子,它在结直肠癌的生长与转移中可能发挥着重要作用。survivin可以调节线粒体内膜电压依赖的离子通道,减少释放细胞色素C;还可以直接与caspase-3和caspase-7相结合,使caspase的活性降低而抑制凋亡。研究发现,survivin在食管癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中呈高表达,与多种恶性肿瘤的发生密切相关。本研究发现,survivin在结直肠癌中68.00%阳性表达,而正常结直肠黏膜中无survivin表达,这与Kawasaki等[10]研究结果相一致;同时流式检测结果也说明在结肠癌中其表达显著高于正常黏膜。提示 survivin可能在结直肠癌的发生或进展中有重要意义。

survivin的表达与肿瘤的淋巴结转移密切相关。从本研究免疫组化结果可以看出,有淋巴结转移组的阳性率显著高于无淋巴结转移组;但是与患者的性别、年龄、癌发部位及分化程度等无关。FCM结果也显示,淋巴结转移组survivin蛋白表达平均 FI值显著高于无转移组,与免疫组化结果相一致。提示survivin高表达的结直肠癌更易发生淋巴结转移,患者可能预后较差。而且,高、中、低分化及粘液癌组的survivin蛋白表达平均 FI值分别为3.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48和3.31±1.06,组间无显著差别;但是正常黏膜组survivin蛋白表达平均 FI值仅为1.00±0.25。提示survivin的高表达可能是发生于结直肠癌发生的早期阶段。

FCM检测结直肠癌标本中survivin的表达,所得结果与免疫组化方法的结果相一致,一方面说明两种检测方法都在检测中比较可靠、方法成熟;另一方面,随着 FCM技术的推广,该技术已比较成熟,操作相对简单、快速且结果比较客观。FCM在肿瘤研究及临床检测等方面表现出更明显的优越性。

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