血管内皮生长因子在实验性大鼠慢性中耳炎中耳粘膜组织中的表达

西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉科(西安710004)

王延辉 许 珉 田 鹏

血管内皮生长因子(VEGF)是血管内皮细胞高特异性的有丝分裂原,具有提高血管对血浆蛋白渗透性的能力,可参与多种炎性疾病发生发展过程。本实验采用免疫组织化学方法对慢性中耳炎大鼠中耳粘膜组织VEGF的表达进行了观察,并对其表达进行了半定量分析,为研究 VEGF在慢性中耳炎炎症中的作用提供实验依据。

材料和方法

1 主要试剂与设备 西安交通大学医学院动物实验中心健康成年SD大鼠 25只,体重220～250g,Preyer反射灵敏,耳镜检查正常;羊抗大鼠V EGF单克隆抗体,DAB显色盒,S-P试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);光学显微镜;1×108L-1金黄色葡萄球菌液由西安交通大学医学院微生物教研室提供。

2 大鼠慢性中耳炎模型建立 25只大鼠均以右耳为实验耳,左耳作正常对照,大鼠用速眠新(0.2～0.3ml)肌肉注射麻醉后,无菌条件下于右耳经鼓膜注射 1×108L-1的金葡菌液 100μl,左耳注入100μl无菌生理盐水作为正常对照。在清洁安静的饲养条件下喂养,观察期间未给大鼠进行任何治疗。注射满1月后处死。大鼠麻醉后,开胸经左心室行升主动脉穿刺,生理盐水快速灌注冲出血液,再用多聚甲醛,戊二醛快速低温灌注后,缓慢滴注1h,取出并剪开双侧听泡,置4℃冰箱2d,充分水洗,10%EDTA脱钙2周。按常规石蜡定向包埋。

3 染色方法 水平位连续切片,隔5～7片取 1片铺片。2张用于HE染色,5张用于VEGF免疫组化染色。免疫组化染色采用S-P法,严格按试剂盒说明书操作,DAB显色后,切片脱水透明,中性树脂封片。空白对照组用 PBS代替一抗,结果为阴性。阳性对照采用试剂盒自带切片。

4 结果判定标准 光镜观察 VEGF表达部位与表达程度,镜下被染成棕色的部位为阳性表达,深棕色为强阳性表达,棕黄色或浅棕色为阴性,采用半定量计分法衡量染色强度:阴性记0分,弱阳性染色记1分,中等染色记 2分,强染色记 3分。在同等条件及400倍镜下,每张切片均选取不相重叠的5个代表部位,分别衡量粘膜上皮细胞的染色强度,将 5个值平均后所得值为该标本测量结果。将大鼠中耳粘膜病变程度根据HE染色分为3级:Ⅰ级:鼓室粘膜和粘膜下组织水肿和炎细胞浸润,粘膜杯状上皮细胞胞核深染,并见新生的小血管组织、成纤维细胞,未见钙化。Ⅱ级:中耳粘膜上皮下结缔组织见均质红染的玻璃样变,纤维组织增生,坏死组织中发生钙化。Ⅲ级:钙化的范围进一步扩大,玻璃样变物质减少,其周围见大量纤维组织增生,修复的纤维层方向紊乱,成骨细胞增生,可见新生的骨组织。

4 统计学处理 实验数据用均数±标准差表示,用 SPSS13.0统计软件包进行统计学分析,表达量的差异用成组设计两样本均数比较的t检验,等级资料的差异用秩和检验,检验水准a=0.05(双侧),P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1 手术显微镜下观察鼓膜及中耳 大鼠空白对照耳(n=25)见鼓膜光滑透亮,富含血管纹的锤骨柄清晰可见,鼓室内粘膜呈淡粉红色,听泡骨壁薄而光滑,未见钙化。实验耳中5耳见鼓膜稍充血,透过鼓膜可见鼓室内少许黄色渗液。其余20耳均出现鼓膜穿孔,残留鼓膜略充血。听泡骨壁增厚粗糙,鼓室内见大量淡黄色粘稠分泌物,用棉拭子将分泌物擦拭干净后,鼓室粘膜充血水肿,明显增厚。其中2耳鼓室腔可见钙化斑。

2 免疫组化染色结果 正常大鼠中耳粘膜VEGF表达较弱,主要表达于成纤维细胞、血管内皮细胞胞浆和胶原基质。慢性中耳炎大鼠中耳粘膜存在弥漫性强阳性表达,VEGF阳性产物定位于细胞胞浆,胞核无着色,阳性细胞聚集成团,排列密集。免疫浸润细胞、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞胞浆内可见弱阳性表达。用SPSS软件配对t检验,t=25.50,二者有明显差异(P＜0.05)。随着炎症程度的增加,VEGF在中耳粘膜中阳性表达强度增加,进一步作两两比较发现不同级别之间差异均有统计学意义(两两组间比 P均＜0.05)。

表1 VEGF在实验组及对照组中耳粘膜中表达

表2 VEGF在实验组中耳粘膜中表达

讨 论

研究慢性中耳炎发病机制,尤其是细胞因子在慢性中耳炎中的作用,已成为研究热点[1～3]。但是由于临床操作上的局限性,在人体内难以检测细胞因子在中耳炎表达的过程。比较解剖学的研究结果表明,在实验动物中,大鼠的中耳解剖结构与人的最为相似,本研究从组织学上证明了已成功建立了大鼠慢性中耳炎的模型。

血管内皮生长因子是一种特异地作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子,有诱导血管生成,增加血管通透性等作用。VEGF可增加血管通透,主要是对毛细血管后静脉和小静脉施以影响。VEGF增加血管通透性的作用十分强烈,效应是组织胺作用浓度的5万倍[4]。目前认为:(1)炎症诱导 VECF的表达,从而导致微血管的生长。(2)另一些学者证实VEGF通过合成血小板活化因子影响血管通透性,从而加重炎症的渗出。另一方面,VEGF诱导加强炎症反应[5]。

在中耳炎大鼠粘膜组织中VEGF的表达增强,而且部分炎细胞也参与合成和分泌,表明V EGF可能也参与组织的局部免疫反应。VEGF以自分泌和旁分泌方式特异地作用于血管内皮细胞,通过增加内皮细胞内囊泡器的功能发挥对毛细血管和小静脉的特异性通透作用,这种作用极利于大分子物质如纤维蛋白原的通过,随后发生的血浆外渗致细胞外基质增加,使中耳粘膜发生水肿。VEGF和炎症程度的关系:随着炎性程度的增加,VEGF的表达值有逐渐增加的趋势,I、II、III级 VEGF的表达值之间差异有显著性。显示VEGF表达强度与中耳炎症程度相关。

血管的改建是慢性炎症的一个特征,血管生成有助于受损组织的修复,但持续异常的血管生成却又促使炎症迁延不愈。血浆持续外渗,细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶和炎性细胞的长期存在均不利于受损组织的修复。此外,促血管形成的相关因子大多与成纤维细胞有关,这些因子长期大量的产生会致使受损粘膜过度纤维化。而肉芽组织乃由旺盛增生的毛细血管及纤维结缔组织和各种炎性细胞组成。张全安等[6]研究发现中耳肉芽组织是由潴留渗出液逐步转变而来的,是中耳腔慢性渗出液长期积存的结果。所以推测VEGF在炎症期促进肉芽组织的形成。

综上所述,中耳炎发病机制是一个很复杂的过程,它同时有多种因素起作用,这些因素之间又存在相互关系,而新生血管形成在这其中起了重要作用。深入研究VEGF与慢性中耳炎的关系,有助于进一步了解其发病机制,并为中耳炎的治疗提供一种新的可能途径。

[1] Yellon RF,Leonard G,Marucha PT,etal.Charactcrization of cytokines present in middle ear effusions[J].Laryngoscopc,1991,101(2):165-169.

[2] 孙 斌,陈 钢.肿瘤坏死因子和慢性中耳炎的关系[J].西安交通大学学报,2004,25(5):470-471.

[3] 刘建治,孔维佳.黏蛋白 MUC2,M UCSAC m RNA在分泌性中耳炎大鼠模型的表达 [J].福建医科大学学报,2007,41(3):214-216.

[4] Johnson RB.Vesailar.vascular endothelial growth factor and progression of periodontal diseasea[J].Periodontol,1999,70(8):848-852.

[5] 曾启新.血管内皮生长因子与牙周炎[J].中华医学研究杂志,2003,3(12):1083-1085.

[6] 张全安,梁建民.渗出性中耳炎渗出液的病理转化和肉芽组织形成 [J].临床耳鼻咽喉科杂志,1999,13(1):8-11.