促性腺激素释放激素受体在济宁青山羊垂体和卵巢的分布特点

葛仕豪,万双秀,王树迎

(1.菏泽学院动物科学系,山东菏泽274015;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018)

下丘脑合成的促性腺激素释放激素(GnRH)以脉冲分泌方式到达垂体前叶,调控腺垂体对FSH、LH的合成与分泌[1],GnRH也可直接作用于性腺,调控性腺类固醇激素的分泌,GnRH对生殖功能的调控必须以促性腺激素释放激素受体(GnRHR)为介导[2]。近年来,GnRH R的分布、表达、调节等在神经内分泌、生殖生物学领域得到了深入的研究,但对GnRHR在青山羊垂体和卵巢内的分布却未见有报道,因此我们以高繁殖力的济宁青山羊为研究对象,探讨GnRH R在其垂体和卵巢内的形态结构及分布规律。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选取临床健康、未孕雌性济宁青山羊6只,年龄2～3岁,体重约20 kg。

1.2 取材制片 于2008年9月份宰杀发情期和间情期的济宁青山羊各3只,在发情期取垂体和卵巢,而间情期只取卵巢,分别放入4%多聚甲醛固定,经梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,连续切片,片厚4～6μm,垂体和卵巢组织块每隔10片连续取2片,分为两套切,其中一套用于GnRH R免疫组化SABC染色,另一套用作阴性对照试验。

1.3 免疫组化SABC法染色程序 (1)切片脱蜡至水后,室温条件下 3%H 2O2作用 15 min。(2)微波修复2次后用正常山羊血清室温下封闭30 min。(3)加入兔抗GnRHR血清(1∶150),然后4℃过夜。(4)加入生物素标记的羊抗兔IgG 37℃下30 min。(5)加入SABC复合物37℃下作用30 min。(6)DAB镜下显色5～10 min。(7)苏木素轻度复染,脱水,透明,封片。以上试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

对照试验用正常山羊血清封闭液代替一抗,其余步骤同上。

1.4 图像分析 采用美国Media Cybernetic公司生产的Image-Pro Plus图像分析软件(Version 4.1)对垂体和卵巢进行图像分析。

1.5 数据分析处理 免疫组化图像分析所得数据用EXCEL2003进行统计,数据以平均数±标准差(±S)表示,用 SPSS 13.0进行 t检验和单因子方差分析。

2 结果

2.1 垂体中GnRHR免疫反应阳性细胞 处于发情期的济宁青山羊腺垂体内存在大量GnRH R免疫反应阳性细胞,约占细胞总数的31.5%(表1),细胞呈圆形、梭形、三角形等(见中插彩版图1)。

表1 济宁青山羊腺垂体和卵巢内GnRHR阳性细胞比和平均光密度

2.2 卵巢中GnRHR免疫反应阳性细胞 在发情期,原始卵泡和初级卵泡内未发现GnRHR阳性细胞,但其存在于次级卵泡和成熟卵泡的颗粒层细胞,呈黄色或棕黄色,而在卵泡膜细胞染色较淡或不着色(见中插彩版图2～5)。在间情期,黄体中的阳性物质主要见于粒黄体细胞,膜黄体细胞未见,白体和闭锁卵泡中也存在GnRH R阳性细胞(见中插彩版图6～8)。

次级卵泡内GnRHR阳性细胞比显著低于成熟卵泡(P＜0.05),但平均光密度无明显差异(P＞0.05)。黄体中的粒黄体细胞也表现出较强的反应强度,其阳性细胞比与次级卵泡相比无明显差异(P＞0.05)(表1)。

3 讨论

3.1 GnRHR在垂体内的作用及分布 Szende B[3]和Stenfano La ROsa[4]等分别对大鼠和人的GnRHR阳性细胞在腺垂体内的分布进行了研究,他们都在远侧部的促性腺激素(GTH)细胞上发现有GnRHR阳性物质存在,在神经垂体未发现,这和笔者得出的结论相似。笔者认为在发情期GnRH通过结合GnRHR,以促进GTH的分泌,从而间接促使卵巢内卵泡的发育成熟并排卵。

3.2 GnRHR在卵巢内的作用及分布 济宁青山羊原始卵泡和初级卵泡都未发现GnRH R阳性细胞,Choi J H等[5]在人的原始卵泡和早期囊状卵泡也没有发现GnRHR,说明GnRH对此阶段的卵泡可能没有调控作用。从次级卵泡到成熟卵泡,卵巢颗粒层细胞开始出现GnRHR阳性物质,并且随着卵泡的发育,阳性细胞比逐渐增大,说明GnRH对卵巢性腺类固醇激素的分泌调控能力也逐渐增强,从而促进济宁青山羊发情并排卵。Kogo H等[6]研究了鼠卵巢的GnRHR mRNA,发现其也主要集中分布于卵巢颗粒层细胞,而在卵母细胞和膜细胞未见。济宁青山羊次级卵泡和成熟卵泡GnRHR阳性细胞平均光密度无差异,笔者推断,GnRH与Gn-RHR在济宁青山羊次级卵泡与成熟卵泡的结合能力相似。

Choi J H等[5]用免疫组织化学方法研究发现,在人的卵巢粒黄体细胞发现有GnRHR阳性物质,而在膜黄体细胞未发现,本试验结果与之相似。粒黄体细胞具有分泌性激素的作用,因此笔者认为,GnRH通过与黄体内的GnRHR结合,调控间情期孕酮的分泌。黄体退化后形成白体,济宁青山羊白体和闭锁卵泡内有少量的GnRHR阳性细胞,其是否参与了卵泡的闭锁机制尚有待于进一步研究。

[1] Robert Grosse,Andrea Schmid,Torsten Schoneberg,et al.Gonadotropin-releasing hormone receptor initiates multiple signaling pathways by ex clusively coupling to Gq/11 p roteins[J].The Journal of Biological Chemistry,2000,275(13)：9193-9200.

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[3] Szende B,Srkalovic G,Timar J,et al.Localization of receptors for luteinizing hormone-releasing hormone in pancreatic and mammary cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci,1991,88：4153-4156.

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[5] Choi J H,Gilks CB,Auersperg N,et al.Immunolocalization of Gonadotropin-Releasing Hormone(Gn RH)-I,GnRH-II,and Type-I GnRH Receptor during Follicular Development in the Human Ovary[J].The Endocrine Society,2006,9：1-30.

[6] Kogo H,Fujimoto T,Park M K,et al.Gonad otropin-releasing hormone receptor m RNA expression in the ovaries of neonatal and adult rats[J].Cells Tissues Organs,1999,164：14-22.